李翔宇，楊雪霞，周美華，曹張軍

（1.東華大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620；2.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620；3.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620）

還原法羽毛角蛋白再生材料二級結(jié)構(gòu)的差異解析

李翔宇1，楊雪霞2，周美華2，曹張軍3

（1.東華大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620；2.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620；3.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620）

建立一種解析還原法羽毛再生材料中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)差異的方法。對降解所得不同形式角蛋白再生物進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜的測試，通過對其酰胺III帶的分析，確定在羽毛的再生過程中所得的兩種不同形式的降解物（角蛋白溶液和角蛋白凝膠）的二級結(jié)構(gòu)的差異。實(shí)驗(yàn)證明：在角蛋白溶液中，α-螺旋占優(yōu)勢，含量在β-折疊之上；而在角蛋白凝膠物中，β-折疊占優(yōu)勢，說明這種結(jié)構(gòu)的角蛋白分子之間更容易生成氫鍵等物理交聯(lián)，在一定的環(huán)境條件，促使形成致密的角蛋白交聯(lián)物。該法快速、有效、穩(wěn)定和敏感，適用于檢測還原法羽毛角蛋白再生材料二級結(jié)構(gòu)。

羽毛角蛋白；酰胺III帶；α-螺旋；β-折疊

0 引 言

角蛋白是來源最豐富的蛋白之一，包括哺乳動(dòng)物，爬行動(dòng)物和鳥類的毛發(fā)、羽毛、指甲和角。全球每年產(chǎn)生的廢棄角蛋白可達(dá)3億噸，除少部分作為保暖填充材料外，絕大部分被廢棄而沒有得到充分利用；不僅引起嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且造成了資源的浪費(fèi)，同時(shí)對于角蛋白的處理涉及到了復(fù)雜的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)問題。角蛋白再生材料具有很好的吸水性、柔韌性及生物相容性，在纖維、醫(yī)藥、離子吸附等領(lǐng)域具有很好應(yīng)用前景。

角蛋白的再生利用與蛋白高級結(jié)構(gòu)（三級及四級）有重要的關(guān)系，而蛋白三級及四級結(jié)構(gòu)由二級結(jié)構(gòu)決定。張益奇等[1]研究了汽爆處理對羽毛角蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。Ping Sun等[2]利用1-丁基-3-甲基咪唑氯制成了能夠吸收重金屬離子的角蛋白顆粒，針對處理前后的角蛋白進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)的解析。而Pedram等[3]利用尿素、EDTA、巰基乙醇和羥甲基氨基乙烷處理羽毛得到角蛋白海綿和角蛋白納米顆粒，僅定性分析了兩者二級結(jié)構(gòu)的不同。

目前研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常用方法有傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、拉曼光譜、圓二色光譜（CD）、X射線衍射、核磁共振技術(shù)、熒光和紫外光譜等，但各有其局限性[1]。相比較之下，F(xiàn)TIR有其獨(dú)特之處，它沒有任何遮蔽效應(yīng)，不破壞樣品的振動(dòng)分子光譜技術(shù)，可提供的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息豐富。同時(shí)，對圖譜的去卷積處理可提高光譜的表觀分辨率，并保留吸收峰面積[4]。將FTIR與去卷積（Deconvolution）、二階導(dǎo)數(shù)譜（Second derivative spectrum）和曲線擬合（Curvefitting）等數(shù)學(xué)處理方法結(jié)合來研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，已得到廣泛應(yīng)用。

基于此，本文利用尿素（CO（NH2）2）、偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）和十二烷基硫酸鈉（SDS）通過還原法將羽毛降解，得到的不可交聯(lián)羽毛角蛋白和可交聯(lián)羽毛角蛋白的紅外光譜，對蛋白二級結(jié)構(gòu)各形式進(jìn)行了定量研究，得到角蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成含量，為角蛋白能否再生提供進(jìn)一步研究基礎(chǔ)。

1 試樣制備與試驗(yàn)方法

1.1 材料

羽毛（杭州蕭山新塘霞江羽絨服廠），尿素（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），偏重亞硫酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），十二烷基硫酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；SHZ-88A往復(fù)式水浴恒溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），傅里葉變換紅外-拉曼光譜儀（Nicolet Nexus 670+Raman Module，美國賽默飛世爾科技公司），冷凍干燥機(jī)（LYQQLEST-5，北京貝吉爾生物有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 還原液的配制

由Kazunori Katoh等[5]的還原法和我們的初期實(shí)驗(yàn)[6]證實(shí)：偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）濃度對角蛋白存在形態(tài)起重要作用。改變Na2S2O5的質(zhì)量濃度配制A、B還原液：其中，尿素6mol/L，SDS 0.05mol/L，還原液A：Na2S2O50.025mol/L，還原液B：Na2S2O50.15mol/L。并在95℃水浴鍋中預(yù)熱加速溶解。

1.2.2 羽毛的降解

將5g烘干羽毛分別加入到50mL上述還原溶液中，置于95℃往復(fù)式水浴恒溫振蕩器中，100r/min震蕩20～25min，利用紗布過濾去除殘?jiān)?，得到羽毛角蛋白降解液A1和B1。

1.2.3 不可交聯(lián)角蛋白與可交聯(lián)角蛋白的制備

將A1和B1角蛋白溶液置于室溫下15min，B1溶液即可發(fā)生交聯(lián)，成為角蛋白凝膠物B2，而A1仍為液體，為不可交聯(lián)A2。

1.2.4 FTIR測定

將獲得的A2和B2用14KDa的半透膜透析3d，除去小分子鹽類等雜質(zhì)后，將其冷凍干燥，得到角蛋白固體A3和B3。將羽毛和A3和B3分別與溴化鉀研磨壓片，利用傅里葉變換紅外-拉曼光譜儀采集紅外譜圖，測量的參數(shù)掃描范圍為400～4000cm-1。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用omnic8數(shù)據(jù)處理軟件處理紅外原譜，用peakfit4.12處理得到子峰，其殘差r2＞0.9，確認(rèn)峰位歸屬，計(jì)算各子峰面積的相對百分含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不可交聯(lián)與可交聯(lián)角蛋白形貌特征

將羽毛加入還原液A和B后，在環(huán)境條件為95℃、100r/min中加熱震蕩得到降解液A1和B1，然后置于室溫15min，便獲得不可交聯(lián)液A2和交聯(lián)的角蛋白B2，圖1（a）和圖1（b）分別表示A2和B2。

從圖1（a）知，不可交聯(lián)的角蛋白液A2呈黃色透明液；圖1（b）是交聯(lián)角蛋白B2，為白色凝膠狀，是比較致密、有彈性、可拉伸的角蛋白彈性體，可以直接作為應(yīng)用材料。在目前的研究中，角蛋白凝膠能夠促使外圍神經(jīng)的快速再生，并且可以與自體神經(jīng)移植相媲美[7]；也可以作為傷口敷料和細(xì)胞支架[8]；又因?yàn)槠渚哂兄寡男再|(zhì)，而被開發(fā)為止血?jiǎng)9]。而A2則可以作為蛋白質(zhì)原料，進(jìn)一步加工處理，才能制備成有用的材料。

圖1 羽毛角蛋白降解物

2.2 FTIR的測定結(jié)果

角蛋白液A2和凝膠角蛋白B2置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得到粉末狀固體A3和含有大量孔隙的塊狀固體B3。圖2為羽毛、A3和B3的紅外圖譜。

圖2 羽毛、A3、B3的紅外譜圖

酰胺帶的歸屬中，3306cm-1處寬而強(qiáng)的吸收帶為N-H和O-H伸縮振動(dòng)吸收帶[1]。肽鍵的振動(dòng)都是來自于酰胺I、II、III帶，酰胺I帶主要是C=O的伸縮振動(dòng)，與氫鍵作用力密切相關(guān)[10]，主要發(fā)生在1600～1 700cm-1范圍內(nèi)；酰胺II帶主要涉及N-H的彎曲振動(dòng)和C-H的拉伸振動(dòng)；酰胺III帶主要涉及1 220～1300cm-1范圍，是C-N鍵的伸縮振動(dòng)以及N-H鍵在平面的彎曲，還有C-C的拉伸振動(dòng)和C=O的彎曲振動(dòng)[2]。另外，1072，1057，1073cm-1對應(yīng)烷基硫代硫酸鹽中對稱的S-O的伸縮振動(dòng)[2]。

酰胺I帶的峰歸屬如下：1613～1637cm-1為β-折疊，1637～1645cm-1為無規(guī)則卷曲，1645～1662 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1662～1682cm-1為α-螺旋，1682～1689 cm-1為β-折疊。酰胺III帶峰的歸屬如下：1220～1250 cm-1為β-折疊，1 250～1 270 cm-1為無規(guī)則卷曲，1 270～1 295cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 295～1 330 cm-1為α-螺旋[1]。在指認(rèn)峰的歸屬時(shí)，應(yīng)該注意：酰胺I帶中α-螺旋和無規(guī)卷曲相鄰較近，峰的確認(rèn)要注意；但在酰胺III帶中α-螺旋和無規(guī)卷曲距離較遠(yuǎn)，易于確認(rèn)[11]。為了清楚起見，將紅外圖譜局部放大。圖3為3者酰胺I帶（1600～1700cm-1）的局部放大圖。

從圖3可以看出，在羽毛中，其酰胺I帶的峰位為1 646 cm-1；在不可交聯(lián)角蛋白中，其酰胺I帶的峰位為1 654 cm-1；交聯(lián)角蛋白的酰胺I帶峰位為1651cm-1。如果蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)改變，酰氨基譜帶的最高點(diǎn)就會發(fā)生遷移，酰氨基譜帶向低波數(shù)遷移說明β-折疊的增加，因此，3者β-折疊的變化依次為先減少后增加。這是因?yàn)轷０稩帶的氫鍵作用較強(qiáng)時(shí)，C=0的電子云密度低，吸收帶偏向1 600 cm-1的較低波數(shù)范圍內(nèi)，反之，則偏向1 700cm-1的較高的波數(shù)范圍內(nèi)[10]。這個(gè)現(xiàn)象也在下面對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致分析的時(shí)候得到驗(yàn)證。

圖3 羽毛、A3、B3在酰胺Ⅰ帶的紅外光譜局部放大圖

2.3 不同降解條件下羽毛角蛋白酰胺I和酰胺III帶曲線擬合

將圖3中酰胺III帶的譜圖利用omnic8、peakfit4.12進(jìn)行傅里葉去卷積處理和高斯擬合，結(jié)果見圖4和表1。

從表1可以看出，破壞羽毛角蛋白的二硫鍵，發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的改變，成為不可交聯(lián)的角蛋白，之后再次發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的重組。β-折疊的含量由羽毛中占絕對優(yōu)勢的45.2%變化為23.4%和41.5%；α螺旋由最初的15.4%分別變化為41.8%和28.9%；而無規(guī)則卷曲在兩種不同的變化下，都是呈現(xiàn)增加趨勢，由17.5%變?yōu)?9.6%和23.2%。當(dāng)角蛋白以溶液形式存在時(shí)，肽鏈以單鏈形式存在，此時(shí)疏水作用明顯，以分子內(nèi)氫鍵為主，形成螺旋或者折疊的結(jié)構(gòu)，這種構(gòu)象對剪切相對不敏感；而當(dāng)形成角蛋白交聯(lián)物時(shí)，肽鏈更傾向于形成更穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵，β-折疊含量增多。角蛋白溶液在變?yōu)榻堑鞍捉宦?lián)物的過程中，不穩(wěn)定的α-螺旋逐漸向更加穩(wěn)定的β-折疊轉(zhuǎn)變[12-13]，促使致密角蛋白交聯(lián)物的形成。

將酰胺 I帶的譜圖利用 omnic8、peakfit4.12進(jìn)行傅里葉去卷積處理和高斯擬合，結(jié)果見圖5和表2。

在酰胺I帶中，所發(fā)生的變化與酰胺III帶非常類似：β折疊由42.6%變化為28.3%和41.6%，而α螺旋由15.9%變?yōu)?7.7%和31.3%，與酰胺III帶相比，相差均在5%以內(nèi)。

孫續(xù)國等[14]研究認(rèn)為蛋白在受到外界因素的影響時(shí)，會造成蛋白二級結(jié)構(gòu)中β-折疊增多，多個(gè)β-折疊部分重合形成微細(xì)蛋白纖維，并進(jìn)一步以SAP為中心形成纖維狀結(jié)構(gòu)，成為能夠造成組織細(xì)胞損壞和功能低下的淀粉樣沉積。馮凌凌等[15]在研究外界條件對大豆分離蛋白溶解性影響時(shí)認(rèn)為，適當(dāng)提高溫度會打開蛋白致密結(jié)構(gòu)，改變二級結(jié)構(gòu)，特別是α-螺旋和β-折疊，加強(qiáng)了蛋白與水的作用，從而提高其溶解性。這都與本文所得結(jié)果相一致。

圖4 角蛋白酰胺Ⅲ帶擬合曲線

表1 羽毛、A3、B3二級結(jié)構(gòu)比例

3 結(jié)束語

圖5 角蛋白酰胺I帶擬合曲線

表2 羽毛、A3、B3二級結(jié)構(gòu)比例

角蛋白凝膠因其具有止血性，增加細(xì)胞的附著和增殖，并且能夠調(diào)控重要基因的表達(dá)而在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛應(yīng)用。羽毛的再生過程中，可以得到兩種不同形式的降解物，一種以角蛋白降解液的形式存在，另外一種是以角蛋白凝膠的形式存在。為了研究兩者差異的原因，本文利用FTIR測定羽毛角蛋白降解再生所形成的角蛋白溶液和角蛋白凝膠的紅外光譜，并在軟件支持下，對兩種再生材料的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定計(jì)算；證實(shí)整個(gè)再生的過程中，蛋白二級結(jié)構(gòu)與羽毛再生材料的形態(tài)存在對應(yīng)關(guān)系。偏重亞硫酸鈉具有調(diào)節(jié)其形態(tài)的作用，在角蛋白溶液中，α-螺旋占優(yōu)勢；而在角蛋白凝膠物中，β-折疊占優(yōu)勢，說明這種結(jié)構(gòu)的角蛋白分子之間更容易生產(chǎn)氫鍵等物理交聯(lián)，在一定的環(huán)境條件，促使形成致密的角蛋白交聯(lián)物。

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The research of secondary structure’s distinction of keratin regeneration materials obtained by reduction

LI Xiang-yu1，YANG Xue-xia2，ZHOU Mei-hua2，CAO Zhang-jun3
（1.Key Laboratory of Science&Technology of Eco-Textile（Donghua University），Ministry of Education，Shanghai 201620，China；2.Chemistry and Chemical and Biological Engineering，Donghua University，Shanghai 201620，China；3.College of Environmental Science&Engineering,Donghua University，Shanghai 201620，China）

A method was established for identifying the secondary structure's distinction of keratin regeneration materials obtained by reduction.In this study，through the analysis of two kinds of different forms of keratin in Fourier transform infrared spectroscopy testing and amide III belt，we can know the secondary structure’s distinction of keratin regeneration materials（keratin solution，keratin solution）.Experiments show that in keratin solution，alpha helix predominates，content on beta fold;In keratin jello，beta folding edge，illustrates the structure of keratin easier to produce hydrogen bond between molecules such as physical crosslinking， in certain environmental conditions，to form a dense keratin crosslinking.This method is effective，stable，high sensitive.It is suitable for identifying the secondary structure’s distinction of keratin regeneration materials obtained by reduction

feather keratin；amide III belt；α-spiral；β-fold

O657.39；Q683；Q512+.6；Q591.2

：A

：1674-5124（2014）05-0065-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.017

2014-02-17；

：2014-05-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000989）

李翔宇（1988-），女，山東德州市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樯锘ぁ?/p>