劉大軍 秦智偉 周秀艷 辛 明 武 濤

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150070）

利用SSH技術(shù)鑒定黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因

劉大軍1，2秦智偉1*周秀艷1辛 明1武 濤1

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150070）

采用SSH技術(shù)對(duì)黃瓜抗霜霉病自交系M801-3-1侵染霜霉病菌前后的差異表達(dá)基因進(jìn)行了研究。利用 SSH 技術(shù)構(gòu)建抗病黃瓜材料接種霜霉病菌和未接種差異表達(dá)的差減cDNA文庫(kù)。經(jīng)反向Northern blot雜交檢測(cè)，共得到48個(gè)陽(yáng)性克隆。利用分子生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和聚類、拼接，共得到 14個(gè)UniESTs，其中包括8個(gè)singletons和6個(gè)contigs。通過(guò)SSH-EST代表基因功能的分析，說(shuō)明抗氧化脅迫能力和葉綠體的重建和保護(hù)機(jī)制對(duì)抗病品種抗病有重要作用。同時(shí)，提出SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶還可能參與了R基因介導(dǎo)的防御反應(yīng)，smHSP有可能就是R蛋白的“保衛(wèi)靶”，負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的異常，這一發(fā)現(xiàn)為揭示活性氧機(jī)制和R基因介導(dǎo)的防衛(wèi)機(jī)制之間的關(guān)系提供了關(guān)鍵證據(jù)。

黃瓜；霜霉病；SSH技術(shù)

黃瓜霜霉病是由卵菌綱的古巴假霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）引起的。黃瓜生產(chǎn)中霜霉病是具有毀滅性的葉部病害，近年來(lái)隨著病原菌的變異，有加速流行的趨勢(shì)。Helena等（2011）結(jié)合前人的研究對(duì)黃瓜霜霉病抗性遺傳的相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)的論述（劉艷玲 等，2009；李建武，2010）。人們已經(jīng)對(duì)黃瓜霜霉病的發(fā)病過(guò)程十分了解（石延霞，2002；劉艷玲 等，2009），利用藥劑防治已經(jīng)可以在一定程度上控制該病的發(fā)生（朱書(shū)生，2005；張曉，2008；喬桂雙，2009），但藥劑的使用存在食品安全問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題，同時(shí)也存在霜霉病菌的抗藥性問(wèn)題（劉曉宇，2004）。培育并使用抗病品種無(wú)疑是減輕該病危害的最有效措施（Branca et al.，2005；李建武，2010；牛德 ，2010）。因此，黃瓜抗霜霉病基因的發(fā)掘和黃瓜抗霜霉病機(jī)制的深入研究對(duì)于黃瓜抗霜霉病育種和黃瓜生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。

抑制性差減雜交（SSH）技術(shù)是由Diatchenko等（1996）提出。Yang等（1999）將SSH技術(shù)與微陣列篩選技術(shù)進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，大大提高了鑒定差別表達(dá)基因檢測(cè)的效率。SSH技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功應(yīng)用于抗病基因分離的研究。駱蒙（2001）構(gòu)建了白粉病誘導(dǎo)小麥葉片的特異性差減文庫(kù)，獲得大量EST序列，根據(jù)這些EST推測(cè)肌醇脂信號(hào)系統(tǒng)、SA信號(hào)系統(tǒng)、MAP相關(guān)信號(hào)傳遞系統(tǒng)可能參與小麥白粉病過(guò)程。于秀梅（2006）構(gòu)建了小麥接種條銹菌后不同時(shí)間的cDNA文庫(kù)，共獲得652個(gè)抗病相關(guān)基因和抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的Unigenes。劉蕾等（2012）構(gòu)建了青枯菌侵染相關(guān)的抑制性差減雜交文庫(kù)，篩選出44個(gè)差異表達(dá)基因，并利用基因敲出技術(shù)對(duì)差異表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證。趙胡 （2012）構(gòu)建了鎘脅迫的SSH文庫(kù)，分離出600個(gè)獨(dú)立克隆。Norelli等（2009）構(gòu)建了蘋(píng)果火疫病侵染前后的SSH文庫(kù)，獲得468個(gè)非冗余序列，并得出侵染前后表達(dá)基因不同的結(jié)果。Verica等（2004）利用SSH技術(shù)構(gòu)建了可可葉片受病害相關(guān)激素類物質(zhì) BTH、JAS、ET和誘導(dǎo)子蛋白Nep1處理的差異表達(dá)EST文庫(kù)，鑒定出330個(gè)防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因。Peng等（2009）利用SSH構(gòu)建了綠僵菌產(chǎn)孢細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中優(yōu)先表達(dá)的特異基因文庫(kù)，共獲得109個(gè)EST，推測(cè)這些基因參與綠僵菌產(chǎn)孢的發(fā)育調(diào)節(jié)。Zhao等（2008）利用SSH技術(shù)構(gòu)建了水稻紋枯病侵染水稻cDNA文庫(kù)，獲得50個(gè)差異表達(dá)克隆，發(fā)現(xiàn)這些基因中有25個(gè)與水稻稻瘟病和水稻白葉枯病侵染表達(dá)基因相同，并認(rèn)為真菌和細(xì)菌的防御響應(yīng)基因是相同的。

前人已經(jīng)對(duì)黃瓜霜霉病的發(fā)病規(guī)律、黃瓜抗霜霉病機(jī)制做了大量研究。丁國(guó)華等（2005）采用抗病基因類似序列（resistance gene analog，RGA）克隆和標(biāo)記基因的策略，獲得了15個(gè)RGA片段。李金鑫（2007）以抗霜霉病黃瓜東農(nóng)129為試材，利用差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDRT-PCR）研究了黃瓜接種霜霉病菌前后基因表達(dá)的差異，鑒定出了4個(gè)抗病相關(guān)基因。王麗娟等（2010）以抗霜霉病黃瓜品種649的葉片為材料，接種黃瓜霜霉病菌后，構(gòu)建了黃瓜葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，得到427個(gè)與植物防御、抗病相關(guān)的基因。李建吾等（2011）以高抗霜霉病的黃瓜自交系為材料，構(gòu)建了兩個(gè)抑制差減文庫(kù)，經(jīng)反向Northern雜交篩選、測(cè)序和序列比對(duì)，篩選到3個(gè)未知功能抗病相關(guān)基因。Taler等（2004）通過(guò)部分測(cè)序甜瓜的抗霜霉病的差異蛋白得到2個(gè)基因At1和At2，轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明基因At1和At2可提高感病甜瓜品種的抗霜霉病能力?？奠o（2007）分別從甜瓜和黃瓜上克隆出了At2基因，并將其轉(zhuǎn)入黃瓜得到轉(zhuǎn)基因植株。黃瓜基因組測(cè)序完成后，大量黃瓜R基因被鑒定出來(lái)，At基因也被鑒定出來(lái)，并被列為黃瓜抗霜霉病的重要候選基因（Huang et al.，2009）。Taler等（2004）指出與經(jīng)典的R基因不同的是，基因At1和At2屬酶促抗性（enzymatic resistance）基因，簡(jiǎn)稱eR基因，同時(shí)說(shuō)明在甜瓜中可能也存在R基因介導(dǎo)的霜霉病抗性，只是目前尚未發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)在基因組測(cè)序已經(jīng)完成的背景下，利用抑制性差減雜交（SSH）技術(shù)獲得多個(gè)與霜霉病菌侵染相關(guān)的EST序列，通過(guò)BLAST比對(duì)確定黃瓜基因組中與EST序列同源的基因，以期明確黃瓜抗霜霉病的相關(guān)基因的表達(dá)機(jī)制和黃瓜抗霜霉病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

試驗(yàn)于2010年秋在哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組選育的抗霜霉病自交系M801-3-1和感病自交系M302-3為材料。在黃瓜霜霉病田間發(fā)病時(shí)從黃瓜病葉上收集病原菌，并在感病自交系M302-3上進(jìn)行純化，接種后的葉片發(fā)病時(shí)收集病原菌。培育健康的M801-3-1幼苗，二葉一心時(shí)接種黃瓜霜霉病菌孢子懸浮液，孢子囊濃度為1×105個(gè)·mL-1，以噴施清水為對(duì)照，噴施于真葉的背面，放入光照培養(yǎng)室，溫度22 ℃，空氣濕度100%，塑料袋覆蓋幼苗，避免光照培養(yǎng)室內(nèi)空氣流動(dòng)造成葉片萎蔫，先24 h黑暗處理，之后，光周期為12 h/12 h（光照/黑暗）。在接種后的0、6、12、24、48、72 h取植株葉片，液氮處理后在-80 ℃中保存。

1.2 mRNA的分離和提取

使用TaKaRa 公司的 RNAiso Plus and RNAiso Mate for Plant Tissue 試劑盒進(jìn)行總 RNA 的提取。mRNA 的分離、純化使用 A.P mRNA Purification Kit，純化后檢測(cè) mRNA 樣品的濃度及純度。

1.3 SSH cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建

SSH的全過(guò)程參考Clontech公司的PCRSelectTMcDNA Subtraction Kit使用手冊(cè)進(jìn)行。以0～72 h侵染處理的混合試材作為 tester，將清水對(duì)照作為 driver。首先將分離、純化后的 mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈 cDNA，用 RsaⅠ對(duì)雙鏈 cDNA 進(jìn)行酶切，在tester 兩端加上接頭1和接頭2R，進(jìn)行2 次消減和2次 PCR擴(kuò)增，富集差異表達(dá)基因。第1次PCR 反應(yīng)體系：無(wú)菌水19.5 μL，10×PCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μL，dNTP（10 μmol·L-1） 0.5 μL，PCR 引物 1（10 μmol·L-1） 2.0 μL，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μL，總體積25.0 μL。第1次循環(huán)體系：27 個(gè)循環(huán)， 94 ℃30 s、66 ℃30 s、72 ℃1.5 min。第2次PCR 反應(yīng)體系：無(wú)菌水18.5 μL，10×PCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μL，巢式引物1、巢式引物2R（10 μmol·L-1） 各 1.0 μL，dNTP（10 μmol·L-1） 0.5 μL，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μL，總體積24.0 μL。第2次循環(huán)體系：10～12 個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s、68 ℃30 s、72 ℃1.5 min。引物和序列如下。接頭1 序列：5'-CTAATACGACTCACTATAGGG CTCGAGCGGCCGCCGCCCGGGCAGGT-3'，5'-ACC TGCCCGG-3'；接頭2R序列：5'-CTAATACGACTCACTATAGG GCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5'-ACCTCGGCCG-3'。引 物1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC -3'。巢式引物1：5'-TCGAGCGGCCGCCGCCCGGGCAGGT-3'。巢式引物2R：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'（接頭1和接頭2R的序列、巢式引物序列根據(jù)手冊(cè)提供序列）。

1.4 差減文庫(kù)生成

兩次擴(kuò)增產(chǎn)物用TaKaRa公司DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0進(jìn)行純化，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞GM109，在Amp/IPTG/X-Gal培養(yǎng)基上鑒定陽(yáng)性克隆。挑取單個(gè)白斑菌落進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0提取質(zhì)粒。

1.5 反向Northern blot鑒定陽(yáng)性克隆

制備探針：將0～72 h侵染處理的混合試材和清水對(duì)照試材分離、純化后的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈cDNA，用RsaⅠ對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行酶切，分別用地高辛（Roche）進(jìn)行標(biāo)記，檢測(cè)標(biāo)記效率。

反向Northern驗(yàn)證陽(yáng)性克?。豪贸彩揭?（5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'）和 巢式引物2R（5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'）對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL點(diǎn)在immobilon-Ny+帶正電尼龍轉(zhuǎn)印膜上，用標(biāo)記好的探針與點(diǎn)陣膜進(jìn)行雜交，具體操作方法參照Roche DIG-High Prime DNA Lableing and Detection Starter KitⅡ試劑盒的操作說(shuō)明。

1.6 差異表達(dá)基因的測(cè)序及序列分析

1.6.1 序列前處理和聚類拼接 將經(jīng)過(guò)反向Northern blot驗(yàn)證后有差異的陽(yáng)性克隆送去測(cè)序。將測(cè)序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行前處理。首先利用vecscreen軟件或http：//ncbi.nlm.nih. gov/repository/vector 去除載體序列，再利用 RepBase（http：//www.girinst.org）去除重復(fù)和低質(zhì)量序列。將前處理后的序列利用CAP3軟件進(jìn)行EST Cluster分析。

1.6.2 序列分析 將所有序列在NCBI上進(jìn)行BLASTn和BLASTx同源性比對(duì)，并且利用geneontology（http：//www.geneontology.org）進(jìn)行功能分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 的提取及 mRNA 的分離純化

經(jīng)純度、濃度檢測(cè)，提取的總RNA的質(zhì)量符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，OD260/OD280在 1.8～2.0。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RNA 的帶形清晰，亮度比值約為2∶1，表明提取的 RNA沒(méi)有被降解。 純化的mRNA 呈抹狀彌散，說(shuō)明 mRNA的質(zhì)量較好，可以用于構(gòu)建差減文庫(kù)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量

2.2 差異表達(dá) cDNA 文庫(kù)的建立

將第2次PCR產(chǎn)物回收、純化，連接到pMD19-T載體上，在含有Amp/IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取文庫(kù)中的 1 000個(gè)陽(yáng)性克隆，利用巢式引物 1 和巢式引物 2R 進(jìn)行驗(yàn)證，如圖 2 所示，片段分布主要集中在 100～500 bp，符合預(yù)期RsaⅠ酶切產(chǎn)物大小，說(shuō)明陽(yáng)性克隆中含有第2次PCR回收產(chǎn)物。隨機(jī)選取80個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行反向Northern blot鑒定。

圖2 cDNA文庫(kù)PCR驗(yàn)證

2.3 反向Northern blot鑒定陽(yáng)性克隆

將差減文庫(kù)中的PCR產(chǎn)物點(diǎn)在尼龍膜上，進(jìn)行點(diǎn)陣列雜交篩選。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為差異表達(dá)cDNA文庫(kù)和兩個(gè)探針。選取出現(xiàn)在tester探針雜交膜上但未出現(xiàn)在 driver探針雜交膜上的陽(yáng)性克隆，或在tester雜交膜和driver雜交膜上均出現(xiàn)，但信號(hào)強(qiáng)度有差別的陽(yáng)性克隆。圖3為差減cDNA文庫(kù)的反向Northern blot驗(yàn)證。最后確定48個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

圖3 反向Northern blot驗(yàn)證

2.4 cDNA差異表達(dá)文庫(kù)序列分析

對(duì)利用反向Northern blot驗(yàn)證得到的48個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得Est序列，通過(guò)CAP3軟件進(jìn)行聚類拼接獲得6個(gè)重疊群Est（Contig1～6），8個(gè)獨(dú)立Est（53、70、73、33、17、52、61、77）。測(cè)序拼接結(jié)果在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI上進(jìn)行BLAST 氨基酸序列同源性比對(duì)，結(jié)果顯示有11個(gè)Est找到了與之匹配的序列，其中包括4個(gè)功能未知的序列（表1）。另外，還有未找到任何比對(duì)信息的3個(gè)序列（Contig3、17、52），推測(cè)這3個(gè)序列可能為新Est序列。

表1 SSH-EST序列黃瓜基因組比對(duì)信息

3 討論

前人已經(jīng)對(duì)黃瓜的抗霜霉病基因進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為黃瓜的抗霜霉病基因是由多對(duì)隱性基因控制的（Shimizu et al.，1963；Doruchowski & Lakowska-Ryk，1992；張勝菊和司龍亭，2009）。黃瓜抗霜霉病的機(jī)制相對(duì)于其他病害更加復(fù)雜，這可能是至今為止沒(méi)有明確地發(fā)現(xiàn)黃瓜抗霜霉病基因的主要原因。牛德（2010）構(gòu)建了接種霜霉病菌后4、8、16、24、48 h和72 h的抗霜霉病黃瓜品種649的葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，結(jié)果顯示：共有1 851個(gè)unigengs獲得相關(guān)的注釋信息，涉及44個(gè)非重復(fù)代謝途徑。接種霜霉病菌后的葉片cDNA文庫(kù)包含抗霜霉病相關(guān)基因，但更多的是與霜霉病抗性非相關(guān)的基因，這一結(jié)果使得后續(xù)進(jìn)行抗病基因發(fā)掘和抗病機(jī)制分析的難度較大。李建武（2010）以高抗自交系IL57經(jīng)霜霉病菌接種32、48、56 h后和清水接種對(duì)照的葉片為材料，采用SSH技術(shù)構(gòu)建了富集黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的正、反向差減文庫(kù)，從正、反向差減文庫(kù)中分別得到了60個(gè)和26個(gè)非重復(fù)序列片段（singleton ESTs）。差減出的相關(guān)功能基因幾乎涉及了植物防御病原菌侵染的全部反應(yīng)過(guò)程并且與抗病反應(yīng)高度相關(guān)。

本試驗(yàn)是以本課題組培育的高代抗病自交系M801-3-1為材料，在接種后的0、6、12、24、48、72 h取樣，獲得有效Est序列48個(gè)，通過(guò)CAP3軟件進(jìn)行聚類拼接獲得6個(gè)重疊群Est（Contig1～6），8個(gè)獨(dú)立Est。相對(duì)于牛德（2010）的試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)采用SSH技術(shù)更有利于霜霉病侵染相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，結(jié)果分析更簡(jiǎn)便，針對(duì)性更強(qiáng)。相對(duì)于李建武（2010）的試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)增加了早期取樣，早期取樣更能反映在黃瓜與霜霉病菌接觸的第一時(shí)間黃瓜做出的抗病性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，有利于揭示黃瓜抗病反應(yīng)的整個(gè)機(jī)制，尤其是前期的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和早期的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。同時(shí)，由于試驗(yàn)材料、取樣時(shí)間和操作方法的不同，本試驗(yàn)獲得的Est與前人的研究結(jié)果有很大不同，后續(xù)將進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序試驗(yàn)驗(yàn)證本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。李建武（2010）的研究認(rèn)為活性氧誘發(fā)的過(guò)敏性抗病機(jī)制在黃瓜抗霜霉病中起重要作用，本試驗(yàn)結(jié)果則表明降低過(guò)敏性的抗活性氧機(jī)制有助于提高抗性。

生物信息學(xué)分析顯示本試驗(yàn)中SSH-EST片段的表達(dá)和活性氧引起的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，高溫、低溫、強(qiáng)光、生物侵染等逆境都能誘發(fā)上述基因的表達(dá)。逆境引起的活性氧傷害主要傷害生物膜和蛋白質(zhì)。清除或減少活性氧有助于減輕逆境造成的傷害。同時(shí)本試驗(yàn)的結(jié)果也為石延霞（2002）關(guān)于高溫提高黃瓜抗霜霉病能力的試驗(yàn)結(jié)果提供了分子水平的解釋，即熱激蛋白等熱激反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生不但提高了黃瓜的抗熱性，也提高了黃瓜抗霜霉病的能力。顧振芳等（2004）研究證實(shí)，黃瓜葉片中葉綠素的含量與黃瓜品系對(duì)霜霉病的抗性呈正相關(guān)。本試驗(yàn)觀察到的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、HSP22、16S核糖體、clpb這些生物大分子的超量表達(dá)都和葉綠體的重建或保護(hù)機(jī)制有關(guān)。黃瓜抗霜霉病品種一般葉色較深，根本原因是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)葉綠體較多，本試驗(yàn)結(jié)果表明，維持葉綠體穩(wěn)定的機(jī)制和促進(jìn)葉綠體形成的機(jī)制都有利于提高黃瓜抗霜霉病的能力。葉綠體的組成元件細(xì)胞色素和鐵氧還原蛋白等對(duì)活性氧極為敏感，逆境中保護(hù)葉綠體內(nèi)成分的穩(wěn)定是黃瓜能否生存的關(guān)鍵，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶具有清除活性氧的功能，鐵硫簇蛋白能夠促進(jìn)鐵氧還原蛋白的形成，保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。另外，HSP22、HSP20、HSP70、clpb和肽脯氨酰異構(gòu)酶含量的變化可能構(gòu)成黃瓜過(guò)敏性反應(yīng)的信號(hào)，這些成分的大量表達(dá)可能標(biāo)志著黃瓜的內(nèi)平衡受到破壞，信號(hào)進(jìn)一步傳遞給R基因形成系統(tǒng)性過(guò)敏壞死反應(yīng)，即HR反應(yīng)。

總之，黃瓜維持葉綠體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和啟動(dòng)葉綠體重建機(jī)制是抗霜霉病品種抗病機(jī)制的重要組成部分。只有維持黃瓜自身代謝的良性運(yùn)轉(zhuǎn)才能為抗病反應(yīng)提供足夠的能源和材料。葉綠體可能是黃瓜與霜霉病病原菌生存競(jìng)爭(zhēng)的“焦點(diǎn)”。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用 SSH 技術(shù)構(gòu)建抗病黃瓜材料接種霜霉病病原菌和未接種差異表達(dá)的差減cDNA文庫(kù)。經(jīng)反向 Northern blot雜交檢測(cè)，共得到48個(gè)陽(yáng)性克隆。利用分子生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和聚類、拼接，共得到 14個(gè) UniESTs，其中包括 8個(gè) singletons 和 6個(gè)contigs。將上述 EST序列在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.icugi.org/）上進(jìn)行 BLAST比對(duì)，有11個(gè) EST 片段找到了與之匹配的同源序列，有3個(gè) EST 片段未找到同源序列，推測(cè)可能是新基因。通過(guò)SSH-EST代表基因功能的分析，推論出抗氧化脅迫能力、葉綠體的重建和保護(hù)機(jī)制對(duì)抗病品種抗病有重要作用。同時(shí)SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶還可能參與了R基因介導(dǎo)的防御反應(yīng)，smHSP有可能就是R蛋白的“保衛(wèi)靶”，負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的異常。

本試驗(yàn)獲得的UniESTs雖然有限但更有針對(duì)性，大多和活性氧反應(yīng)相關(guān)，活性氧迅速產(chǎn)生可使黃瓜在受侵染部位產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)，非侵染部位抑制活性氧產(chǎn)生可使壞死斑受限制形成抗病反應(yīng)?；钚匝鯌?yīng)激反應(yīng)一方面反映了黃瓜受霜霉病菌侵染后對(duì)于自身內(nèi)環(huán)境的平衡性修復(fù)需要，另一方面也可能作為逆境信號(hào)的傳導(dǎo)機(jī)制，啟動(dòng)黃瓜抗病的形態(tài)建成和生理環(huán)境。活性氧應(yīng)激反應(yīng)在其他溫度逆境、水分逆境、光照逆境和生物侵染逆境中可能具有相似作用。利用活性氧應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)理論可以育成更加抗病的黃瓜品種，也可以制定出相應(yīng)的栽培技術(shù)措施進(jìn)行黃瓜病害的綜合防治。

今后可利用RNAi干擾技術(shù)敲出和超量表達(dá)SSH-EST相關(guān)基因，驗(yàn)證這些基因在黃瓜抗霜霉病中的功能。也可以利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，進(jìn)一步分析引起黃瓜不同品種產(chǎn)生抗感差異的機(jī)制。

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Using SSH Technology to Identify Relevant Genes Resistant to Cucumber Downy Mildew

LIU Da-jun1，2，QIN Zi-wei1，ZHOU Xiu-yan1，XING Ming1，WU Tao1

（1HorticultureCollege，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，Heilongjiang，China;2HarbinCityAgriculturalInstitute，Harbin150070，Heilongjiang，China）

Adopting SSH technology，this paper studied on the difference expressive genes of downy mildew resistant cucumber inbred line ‘M801-3-1’ before and after the infection of downy mildew．Diseaseresistant cucumber material vaccinated downy mildew and unvaccinated cDNA library was constructed using SSH technology．Forty-eight positive clones were obtained by reverse Northern blot hybridization detection，and 14 UniESTs were obtained including 8 singletons and 6 contigs via molecular biology software．The SSH-EST genes function analysis indicated that oxidative stress resistance and chloroplast reconstruction and protection mechanisms had very important role on disease resistance．At the same time，the paper put forward that Clpb，HSP70，HSP22 and peptidyl-prolyl cis-trans isomerase might be involved in the R gene-mediated defense reaction，and smHSP might be the ‘defending target’ of R protein，responsible for monitoring intracellular exception．This study has provided a key evidence for revealing the relations between active oxygen mechanism and R gene mediate protection mechanism．

Cucumber; Downy mildew; SSH technology

劉大軍，男，博士研究生，高級(jí)農(nóng)藝師，專業(yè)方向：黃瓜育種和菜豆育種，E-mail：jianlongedu@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：秦智偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：黃瓜遺傳育種，E-mail：zwqin727@163.con

2013-06-28；接受日期：2013-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272158），“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD02B03），農(nóng)業(yè)部“東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”項(xiàng)目，黑龍江省寒地蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目