楊婷婷，劉雄倫，譚令辭，行 璇，文 婷，梁 毅，吳 俊，劉金靈，戴良英，劉建豐，王國(guó)梁

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；3中國(guó)種子集團(tuán)有限公司，湖北武漢430206；4國(guó)家雜交水稻工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410125；5湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

水稻Pi9基因序列標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其抗瘟育種應(yīng)用

楊婷婷1，2，劉雄倫1，2，譚令辭1，2，行 璇1，2，文 婷1，2，梁 毅3，吳 俊4，劉金靈1，2，戴良英2，5，劉建豐1，王國(guó)梁1，2

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；3中國(guó)種子集團(tuán)有限公司，湖北武漢430206；4國(guó)家雜交水稻工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410125；5湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

利用廣譜抗稻瘟病基因Pi9的3′UTR序列設(shè)計(jì)特異DNA標(biāo)記pi9utr，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和連續(xù)回交育種實(shí)踐，改良7份秈稻親本（316B、金23B、R207、R228、R288、R389、明恢86）的稻瘟病抗性。結(jié)果表明：pi9utr是一個(gè)高效顯性分子標(biāo)記，除R207外，在其余6份受體親本與Pi9供體親本75-1-127間均存在明顯而穩(wěn)定的多態(tài)；在室內(nèi)接種后的316B×75-1-127 BC4F1群體和R288×775-1-127 BC6F1群體中隨機(jī)取樣，進(jìn)行稻瘟病抗性表型和基因型鑒定及Pi9基因表達(dá)分析，證明pi9utr對(duì)兩個(gè)組合回交后代個(gè)體的抗病性輔助選擇效率均為100%，且在所有抗病單株中均能檢測(cè)到Pi9基因的高效表達(dá)，在所有感病單株中均沒(méi)有檢測(cè)到Pi9基因的表達(dá)。利用pi9utr在回交世代中的連續(xù)輔助選擇，獲得了3個(gè)組合的BC4F1及3個(gè)組合的BC6F2代群體，為選育抗稻瘟病新品種打下了基礎(chǔ)。

水稻；稻瘟病抗性；Pi9基因；分子標(biāo)記輔助選擇育種

Key words：Rice；Blast resistance；Pi9 gene；Marker-assisted selection breeding

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約一半人口以稻米為主食［1］。作為水稻主要病害之一的稻瘟?。╮ice blast），可在水稻的不同生育時(shí)期造成危害，流行年份一般使水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無(wú)收［2］。由于多數(shù)雜交稻親本的稻瘟病抗性不強(qiáng)，很大程度上限制了一些強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的推廣應(yīng)用。長(zhǎng)期實(shí)踐表明，發(fā)掘、鑒定和利用廣譜持久抗性基因，選育和推廣抗病品種（組合）是控制稻瘟病害最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的策略［3］。分子標(biāo)記輔助選擇（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）育種可定向改良個(gè)別性狀而不改變受體遺傳背景，且沒(méi)有轉(zhuǎn)基因生物安全性風(fēng)險(xiǎn)，是現(xiàn)代分子育種的重要手段。來(lái)源于小粒野生稻的抗瘟基因Pi9位于水稻第6號(hào)染色體的Pi2／9位點(diǎn)，與Pi2、Pizt、Pigm、Pi50、Pi2-2等抗瘟基因互為復(fù)等位基因，是一個(gè)已經(jīng)被克隆的廣譜持久抗性基因［4～9］。本研究利用Pi9基因序列設(shè)計(jì)并篩選高效DNA標(biāo)記，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)開(kāi)展連續(xù)回交育種，定向改良受體秈稻親本的稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Pi9基因供體水稻親本及稻瘟病室內(nèi)接種抗病對(duì)照：75-1-127；Pi9基因受體水稻親本：316B、金23B、R207、R228、R288、R389、明恢86（湖南雜交水稻研究中心、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所提供）；分子標(biāo)記選擇效率及Pi9基因表達(dá)分析群體：316B×75-1-127 BC4F1、R288×75-1-127 BC6F1；稻瘟病室內(nèi)接種感病對(duì)照水稻品種CO39；稻瘟菌菌株15份（本實(shí)驗(yàn)室收集保存，表1）。

1.2 方法

1.2.1 Pi9基因MAS育種分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

Pi9基因，cDNA 4 009 bp，其中編碼區(qū)3 099 bp，3′UTR 910 bp［5］。利用Pi9 cDNA序列信息設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，用各標(biāo)記分別PCR擴(kuò)增各供試水稻親本的基因組DNA，分析各標(biāo)記在Pi9供體親本75-1 -127與7份受體親本間的多態(tài)性，最終篩選出穩(wěn)定高效的多態(tài)性標(biāo)記用于MAS育種。

1.2.2 室內(nèi)接種表型鑒定及抗譜分析

接種水稻材料包括Pi9供體親本、受體親本、316B×75-1-127 BC4F1群體、R288×75-1-127 BC6F1群體及感病對(duì)照水稻品種CO39，回交群體稻瘟菌菌株為110-2。供試水稻材料播種于塑料盆中，添加花卉營(yíng)養(yǎng)土于溫室（26～28℃，正常光照）中育苗。4葉期時(shí)采用單個(gè)菌株約1×105／mL濃度的稻瘟菌孢子懸浮液室內(nèi)噴霧活體接種，26℃黑暗保濕24 h，再在26～28℃，高濕、正常光照條件下誘導(dǎo)發(fā)病5～7 d。參照Bonman的0～5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情［10］（0～2級(jí)劃為抗病類(lèi)型，3～5級(jí)劃為感病類(lèi)型）。

1.2.3 標(biāo)記基因型分析

室內(nèi)接種后，對(duì)Pi9供體、受體親本、各組合回交后代單株進(jìn)行抗病表型鑒定的同時(shí)，分單株，各取2份新鮮葉片包于錫泊紙中（每份葉片約1.0 g），液氮速凍，放入-80℃冰箱中保存。之后，取出1份，用液氮研磨，CTAB法［11］提取葉片總DNA。用獲選多態(tài)分子標(biāo)記對(duì)各DNA樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（10μL）：DNA模板（約10 ng／μL）1.0μL，2 pmol／μL primer pair 1.0μL，10×Buffer 1.0μL，2.5 mmol／L dNTPs 0.2μL，5U／μL r-Taq酶0.1μL，ddH2O 6.7μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，分析帶型。結(jié)合單株表型和基因型的鑒定，驗(yàn)證多態(tài)分子標(biāo)記的選擇效率。

1.2.4 Pi9基因表達(dá)分析

將方法1.2.3中的另1份水稻葉片樣品用Trizol法提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈于-20℃暫時(shí)存放。用ubiquitin（正向序列：5′-AA GAAGCTGAAGCATCCAGC-3′，反向序列：5′-CCAGGACAAGATGATCTGCC-3′）擴(kuò)增cDNA樣品，PCR循環(huán)20次，反復(fù)調(diào)節(jié)cDNA模板濃度，使ubiquitin擴(kuò)增條帶亮度基本一致；再用上述多態(tài)標(biāo)記引物PCR擴(kuò)增相同濃度下的cDNA模板，瓊脂糖電泳檢測(cè)Pi9基因的表達(dá)。

1.2.5 MAS育種實(shí)踐

利用獲得的高效多態(tài)分子標(biāo)記，用7份秈稻受體親本與75-1-127具有多態(tài)的親本作為Pi9基因的受體親本及輪回親本，開(kāi)展MAS連續(xù)回交育種，改良受體親本的稻瘟病抗性。本研究在前人工作基礎(chǔ)上［12］，自2011～2013年繼續(xù)在長(zhǎng)沙和三亞兩地穿梭進(jìn)行MAS育種試驗(yàn)。將各組合回交后代分兩期在田間單本種植，每期10～15株，苗期單株取樣，用分子標(biāo)記鑒定和選擇抗病基因型，并結(jié)合田間農(nóng)藝性狀，篩選3～5個(gè)單株，與輪回親本回交，構(gòu)建各世代回交群體；達(dá)到BC6F1代的組合，分單株套袋自交獲得BC6F2代，供下一步鑒定和篩選抗病純系。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的稻瘟病抗性與抗菌譜

各供試材料對(duì)15個(gè)稻瘟菌菌株的抗性表現(xiàn)及抗菌譜結(jié)果見(jiàn)表1。Pi9基因供體及抗病對(duì)照75-1 -127的抗性較強(qiáng)、抗譜較廣，對(duì)除ROR1和KOH外的其余13個(gè)菌株表現(xiàn)抗??；感病對(duì)照CO39對(duì)所有15個(gè)供試菌株均表現(xiàn)感病；7份受體親本均對(duì)多數(shù)供試菌株表現(xiàn)感病，表明其稻瘟病抗性均需改良；7份受體親本中，316B、金23B、R288的抗性最差，抗譜最窄；有趣的是，R389對(duì)Pi9基因感病菌株ROR1、KOH都表現(xiàn)抗病，說(shuō)明R389中存在其他的抗瘟基因，改良后有望獲得比75-1-127抗譜更廣的新品種；另外，各受體材料均可找到多個(gè)區(qū)別于Pi9基因抗譜差異的特異致病菌株，可用于分子標(biāo)記輔助選擇效率驗(yàn)證的表型分析。

表1供試水稻材料的抗菌譜

2.2 多態(tài)分子標(biāo)記的篩選

本研究中，利用Pi9基因序列信息設(shè)計(jì)了4對(duì)標(biāo)記引物，分別對(duì)75-1-127和7份受體親本進(jìn)行基因型分析，篩選獲得了多態(tài)性明顯且穩(wěn)定的顯性標(biāo)記pi9utr（正向序列：5′-CATCAGCGAACAGAT AGGGCA-3′，反向序列：5′-GCCCTGCTTGCTCG GAGTAGA-3′）。pi9utr在75-1-127和R207中均擴(kuò)增出一條約1 000 bp的清晰穩(wěn)定條帶，而在其余6份受體親本中均未檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。此結(jié)果表明，分子標(biāo)記pi9utr在Pi9供體親本75-1-127與316B、金23B、R228、R288、R389、明恢86這6份受體親本間存在理想的多態(tài)性，可應(yīng)用于這6對(duì)組合的MAS育種實(shí)踐。

圖1分子標(biāo)記pi9utr對(duì)各親本水稻的基因型分析

2.3 分子標(biāo)記pi9utr的選擇效率

為驗(yàn)證分子標(biāo)記pi9utr對(duì)稻瘟病抗性表型的選擇效率，確保MAS育種結(jié)果的可靠性，對(duì)316B×75 -1-127 BC4F1群體和R288×75-1-127 BC6F1群體進(jìn)行室內(nèi)接種，并分析兩個(gè)群體中隨機(jī)取樣單株的基因型和表型。結(jié)果表明，pi9utr對(duì)兩個(gè)回交后代的表型選擇效率均為100%，所有抗病個(gè)體均擴(kuò)增出一條約1 000 bp的清晰條帶，所有感病個(gè)體均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。

圖2 2個(gè)回交群體的單株標(biāo)記基因型與表型鑒定及Pi9基因表達(dá)分析

2.4Pi9基因的表達(dá)與抗病性關(guān)系

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Pi9基因在回交后代群體中的表達(dá)情況，選取316B×75-1-127 BC4F1群體和R288×75-1-127 BC6F1群體接種后隨機(jī)取樣單株（與2.3同），分別進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，所有含Pi9基因且表型為抗病的個(gè)體都擴(kuò)增出一條467 bp的條帶，所有不含Pi9基因且表型為感病的個(gè)體均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。由此可見(jiàn)，通過(guò)連續(xù)回交與標(biāo)記輔助選擇，目的基因Pi9被成功導(dǎo)入受體親本中且高效表達(dá)，受體親本的稻瘟病抗性明顯改良。

2.5 分子標(biāo)記pi9utr的MAS育種實(shí)踐

利用pi9utr這個(gè)基因內(nèi)高效多態(tài)分子標(biāo)記，利用316B、金23B、R228、R288、R389、明恢86這6份秈稻材料作為Pi9基因的受體親本及輪回親本，于2009～2013年在長(zhǎng)沙和三亞兩地開(kāi)展MAS連續(xù)回交育種。現(xiàn)已獲得了316B、金23B、明恢86與75-1-127三個(gè)組合的BC4F1群體；R228、R288、R389與75-1-127三個(gè)組合的BC6F2群體，這些工作為進(jìn)一步選育抗稻瘟病水稻新品系和新材料奠定了良好基礎(chǔ)。

3 討論

水稻稻瘟病抗性是一個(gè)典型的質(zhì)量—數(shù)量性狀，抗病性表型既由基因控制又受環(huán)境影響，因此傳統(tǒng)育種方法很難進(jìn)行準(zhǔn)確選擇，而分子標(biāo)記輔助選擇育種不但準(zhǔn)確、高效、安全，而且可以在早期選擇，在抗病性育種中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究開(kāi)發(fā)出Pi9基因內(nèi)分子標(biāo)記pi9utr，該標(biāo)記在6份秈稻受體親本的MAS連續(xù)回交育種中表現(xiàn)多態(tài)性明顯穩(wěn)定、選擇效率高，既可用于基因型鑒定和選擇，又可用于目的基因的表達(dá)分析。但是，pi9utr是一個(gè)顯性標(biāo)記，不能有效區(qū)分抗病純合體和雜合體。鑒于此，應(yīng)繼續(xù)開(kāi)發(fā)高效的共顯性標(biāo)記，在高代回交自交群體中篩選抗病純系，提高育種效率。另外，pi9utr在Pi9基因供體親本75-1-127與受體親本R207間無(wú)多態(tài)性，需要開(kāi)發(fā)新的多態(tài)標(biāo)記用于R207的MAS育種。

由于稻瘟病菌生理小種的多樣性及快速變異性，往往導(dǎo)致抗病水稻品種在不同稻區(qū)或年份間抗性不一致、不穩(wěn)定，一定程度上限制了抗性基因和抗性品種的推廣應(yīng)用［13］。實(shí)踐表明，將多個(gè)抗菌譜不同的抗瘟基因聚合到同一個(gè)水稻品種中，是培育廣譜持久抗瘟新品種的良策［14，15］。本研究中的目標(biāo)基因Pi9雖然抗性較強(qiáng)、抗菌譜較廣，但對(duì)來(lái)自韓國(guó)的ROR1和來(lái)自日本的KOH兩個(gè)菌株沒(méi)有抗性。另一個(gè)廣譜抗瘟基因Pigm，與Pi9相比具有交叉抗菌譜，對(duì)ROR1和KOH都表現(xiàn)出高水平抗性，但對(duì)Pi9基因具有抗性的來(lái)自我國(guó)湖北的小種鄂2007046A2沒(méi)有抗性［16］。開(kāi)展包括Pi9、Pigm在內(nèi)的多個(gè)廣譜抗瘟基因的聚合育種，培育出抗譜更廣、抗性更強(qiáng)更持久的水稻新品種將是今后工作的重點(diǎn)。

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Development of the Pi9 Gene Marker and Its Breeding Practice in Rice Blast Resistance

YANG Ting-ting1，2，LIU Xiong-lun1，2，TAN Ling-ci1，2，XING Xuan1，2，WEN Ting1，2，LIANG Yi3，WU Jun4，LIU Jin-ling1，2，DAILiang-ying2，5，LIU Jian-feng1，WANG Guo-liang1，2

（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；3 China Seed Group Co.Ltd，Wuhan，Hubei 430206，China；4 China National Hybrid Rice Research and Development Center，Changsha，Hunan 410125，China；5 College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

To improve blast resistance of seven receptor indica rice lines（316B，Jin23B，R207，R228，R288，R389 and Minghui86），a DNA marker，pi9utrwas developed based on the 3′UTR sequence of the broad-spectrum blast resistance gene Pi9 and marker-assisted selection breeding practice was imp lemented in this study.The main results were as follows：Pi9utr was a stable polymorphic dominantmarker for six of seven tested crosses except R207×75-1-127.The selection efficiency of the pi9utrmarker for blast resistance phenotype was100%，and the Pi9 gene showed high level expression in all resistant plants，according to random ly sampled individuals analyses of two backcross populations，316B×75-1 -127 BC4F1and R288×75-1-127 BC6F1.Pi9utr was employed formarker-assisted selection in consecutive backcross breeding of the six receptor rice lines，and BC4F1populations of three combinations and BC6F2populations of others three combinations were obtained，which provided basis for breeding of new rice varieties with blast resistant.

S511.032；S435.111.4＋1

A

1001-5280（2014）03-0231-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.01

2014 03 01

楊婷婷（1989-），女，浙江溫州人，碩士研究生，Email：815035501＠163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31171526）；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2013ZX08001-002）；教育部高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。