張 陽，張 珍，*，張盛貴，牛黎莉，杜 雨，周 蕓（.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；.甘肅省華池縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，甘肅慶陽745600）

響應(yīng)面法優(yōu)化Ca2+激活牦牛血中凝血酶原工藝研究

張 陽1，張 珍1，*，張盛貴1，牛黎莉1，杜 雨1，周 蕓2
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省華池縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，甘肅慶陽745600）

以牦牛血液為原料，采用檸檬酸鋇吸附法制取凝血酶原。選取激活溫度，Ca2+終濃度，激活時間三個因素，在單因素實驗基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken中心組合實驗，研究了Ca2+激活牦牛血中凝血酶原的工藝條件，實驗結(jié)果表明：激活溫度27℃、Ca2+終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h，在此條件下凝血酶的比活力最優(yōu)為63.3972U/mg。

Ca2+激活，凝血酶原，牦牛，檸檬酸鋇吸附，響應(yīng)面實驗

凝血酶（Thrombin Ec 3.4.21.5）是血液凝固系統(tǒng)中起重要作用的絲氨酸蛋白水解酶，是凝血酶原經(jīng)凝血酶原激活物激活而成的，具有較高的專一性，它能夠促使血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，同時促使血小板聚集，加速血液凝固，從而達(dá)到迅速止血的目的。凝血酶的活性前體物質(zhì)是凝血酶原，其本身沒有活性，不能將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，只有將其激活成凝血酶才有應(yīng)用價值，生理條件下，凝血酶原由凝血因子V、Xa、Ca2+和磷脂共同激活生成凝血酶[1]。實際應(yīng)用中激活的方式有多種：a.用促凝血酶和氯化鈣激活凝血酶原，促凝血酶可由兔腦、人體組織或人體重組器官以及牛腦中獲得[2]；b.用蛇毒激活[3]；c.單獨使用Ca2+激活[4-5]。

目前，國內(nèi)主要從動物血漿中提取凝血酶[6-8]，但尚未有從牦牛血中提取凝血酶的報道。我國是牦牛主產(chǎn)國，占世界牦牛總數(shù)的92%以上，其主要分布于青海、西藏、四川、甘肅、新疆、云南等六省區(qū)的高寒草原區(qū)[9]。牦牛血中含有豐富的營養(yǎng)成分和一些藥用價值很高的酶類，其中就有凝血酶。對牦牛血液的利用，除有報道的從牦牛血液中提取免疫球蛋白IgG[10]、SOD[11]和少量食用外，大量血液遭到丟棄，造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染。因此，從牦牛血中提取凝血酶，既可以充分利用牦牛血資源，提高牦牛血的附加值，又可以減少因污血排放造成的環(huán)境污染，具有重大社會意義。鑒于此，本實驗以檸檬酸鋇吸附法制取凝血酶原，采用Ca2+激活牦牛血中凝血酶原，通過實驗，探索激活牦牛血中凝血酶原的最優(yōu)工藝，以期為屠宰行業(yè)大量污染環(huán)境的牦牛血資源能得到充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牦牛血 取自甘肅夏河；凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品、纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；透析袋 美國進(jìn)口；考馬斯亮藍(lán)G-250、乙醇、磷酸、鹽酸、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化鈉、氯化鈣、氯化鋇、檸檬酸鈉及其他試劑 均為分析純。

高速冷凍離心機(jī)（H-1850R） 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外分光光度計（UV722S） 北京普析通用儀器有限責(zé)公司；分析天枰（FA2004） 上海越平科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S24）

上海一恒科學(xué)儀器有限公司；數(shù)字酸度計（PHS-3C） 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；磁力攪拌器（CJJ78-1） 金壇市大地自動化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量測定 蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法[12]。

1.2.2 凝血酶活力測定 凝血酶活性測定采用中國藥典介紹的方法[13]。

1.2.3 檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原 原理：檸檬酸鈉抗凝獲得的血漿中加入BaCl2產(chǎn)生檸檬酸鋇沉淀，凝血酶原等依賴于維生素K的凝血因子被吸附在檸檬酸鋇上，隨之沉淀分離出來，沉淀用EDTA解吸，棄去沉淀，上清液經(jīng)Tris-HCl透析后即得凝血酶原。

操作步驟：新鮮牦牛血，加入1/10原血液體積濃度為3.8%的檸檬酸鈉作為抗凝劑，-20℃下冷凍3d，4℃解凍后，于3500r/min離心10min，得血漿[14]。取血漿50mL，邊攪拌邊緩慢加入6mL 1mol/L的BaCl2溶液，磁力攪拌1h后4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，收集檸檬酸鋇沉淀，將沉淀溶于等血漿體積pH8.0 0.2mol/L的EDTA溶液中，攪拌1h，4000r/min離心15min棄去不溶物，上清液用0.05mol/L pH7.2的Tris-HCl緩沖液透析，不斷更換透析液，至無Ba2+為止[15]，得凝血酶原液。

1.2.4 凝血酶原的激活 凝血酶原液中加入CaCl2溶液，使其達(dá)一定濃度，在一定溫度下激活一段時間，得凝血酶。

1.2.5 凝血酶原激活工藝單因素實驗設(shè)計

1.2.5.1 激活溫度對凝血酶活力的影響 在Ca2+終濃度0.01mol/L，激活時間2h時，討論激活溫度對凝血酶活力的影響。溫度設(shè)定為5、15、25、35、45℃，重復(fù)三次。

1.2.5.2 Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響 在最適激活溫度，激活時間2h時，討論Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響。Ca2+終濃度設(shè)定為0.005、0.01、0.015、0.020、0.025mol/L，重復(fù)三次。

1.2.5.3 激活時間對凝血酶活力的影響 在最適Ca2+終濃度，最適激活溫度時，討論激活時間對凝血酶活力的影響。時間設(shè)定為1、2、3、4、5h，重復(fù)三次。

1.2.6 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以激活溫度（℃）、Ca2+終濃度（mol/L）和激活時間（h）為自變量（Xi），凝血酶比活力為響應(yīng)值（Y），運用Box-Behnken模型設(shè)計三因素三水平二次回歸方程，擬合自變量與凝血酶比活力之間的函數(shù)關(guān)系。實驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素水平Table 1 Independent variables and their corresponding levels in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對凝血酶活力的影響

2.1.1 激活溫度對凝血酶活力的影響 由圖1可知，凝血酶活力隨激活溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。激活溫度25℃時，凝血酶的活力達(dá)到最大，并與其他水平有顯著性差異（p＜0.05）。當(dāng)激活溫度小于25℃，凝血酶的活力較低，這是由于凝血酶的活性中心結(jié)構(gòu)受溫度的影響[16]，在溫度較低時，凝血酶的活性中心沒有被完全激活，使得凝血酶的活力較低。當(dāng)激活溫度大于25℃，隨著激活溫度的升高，凝血酶的活性逐漸降低，這是由于高溫破壞了其活性中心結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致部分酶活性喪失。因此，選擇25℃為最佳激活溫度。

圖1 激活溫度對凝血酶活力的影響Fig.1 Effect of activating temperature on the activity of thrombin

2.1.2 激活時間對凝血酶活力的影響 由圖2可知，凝血酶活力隨激活時間的增加呈先增大后減小的趨勢。激活時間2h時，凝血酶活力達(dá)到最大，并與其他水平有顯著性差異（p＜0.05）。當(dāng)激活時間小于2h，凝血酶活力較低，這可能是由于凝血酶沒有被完全激活。當(dāng)激活時間大于2h，隨著激活時間的不斷延長，凝血酶的活力逐漸降低，這可能與環(huán)境因素有關(guān)，說明牦牛凝血酶不穩(wěn)定，放置時間越長其酶活損失越多。因此，選擇2h為最佳激活時間。

圖2 激活時間對凝血酶活力的影響Fig.2 Effect of activating time on the activity of thrombin

2.1.3 Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響 由圖3可知，凝血酶活力隨Ca2+終濃度的增加呈先增大后減小的趨勢。Ca2+終濃度為0.01mol/L時，凝血酶的活力達(dá)到最大，并與其他水平有顯著性差異（p＜0.05）。當(dāng)Ca2+終濃度小于0.01mol/L，凝血酶的活力較低，這是由于Ca2+是凝血酶的輔基[16]，在Ca2+終濃度小于0.01mol/L時，凝血酶的活性中心不能被Ca2+完全激活，從而使得凝血酶的活力較低。當(dāng)Ca2+終濃度大于0.01mol/L，隨著Ca2+終濃度的不斷增大，凝血酶的活力逐漸降低，這是由于過多的Ca2+破壞了凝血酶的空間結(jié)構(gòu)，從而使得部分凝血酶活性喪失。因此，選擇0.01mol/L為最佳Ca2+終濃度。

圖3 Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響Fig.3 Effect of final concentration of Ca2+on the activity of thrombin

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果及模型的建立

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法確定牦牛凝血酶原最佳激活工藝，實驗結(jié)果見表2。利用Design Expert軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸模型：Y=63.48+1.04X1-0.22X2+0.27X3+ 0.33X1X2-1.51X1X3+0.77X2X3-3.01X12-1.36X22-0.59X32。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The result and condition of response surface experiment

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

由回歸模型方差分析（表3）可以看出：模型p＜0.0001，模型極顯著；失擬項p=0.5413＞0.05，失擬項不顯著；決定系數(shù)（R2）為0.9881，校正系數(shù)（R2Adj）為0.9728，該模型能解釋97.28%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預(yù)測Ca2+激活牦牛凝血酶原的工藝結(jié)果。在總的作用因素中，回歸方程一次項X1、二次項X12、X22及交互項X1X3、X2X3對激活牦牛凝血酶原的影響均達(dá)極顯著水平。各因素對其的影響順序依次為激活溫度＞激活時間＞Ca2+終濃度。

2.3 響應(yīng)面分析

圖4 Ca2+離子終濃度（B）與激活溫度（A）響應(yīng)面圖Fig.4 Effect of final concentration of Ca2+（B）and activating temperature（A）on viscosity response surface

圖4 顯示了當(dāng)激活時間為中心水平1.95h時，Ca2+離子終濃度和激活溫度對凝血酶活力的交互作用。當(dāng)離子濃度不變時，隨著激活溫度的升高，凝血酶的活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；當(dāng)固定激活溫度不變時，凝血酶的活力隨著Ca2+離子終濃度的增大也呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；Ca2+終濃度和激活溫度在0.075～0.0125mol/L、23～28℃之間時，凝血酶活力有最大值。

圖5 激活時間（C）與激活溫度（A）響應(yīng)面圖Fig.5 Effect of activating time（C）and activating temperature（A）on viscosity response surface

圖5 顯示了當(dāng)Ca2+離子終濃度為中心水平0.01mol/L時，激活時間和激活溫度對凝血酶活力的交互作用。當(dāng)激活時間一定時，隨著激活溫度的升高，凝血酶的活力呈現(xiàn)出先增大后緩慢減小的趨勢；當(dāng)固定激活溫度不變時，凝血酶的活力隨著激活時間的延長呈現(xiàn)出先增大后趨于平緩的趨勢；激活時間和激活溫度在1.5～2.5h、25～30℃之間時，凝血酶活力有最大值。

圖6 激活時間（C）與Ca2+離子終濃度（B）響應(yīng)面圖Fig.6 Effect of activating time（C）and final concentration of Ca2+（B）on viscosity response surface

圖6 顯示了當(dāng)激活溫度為中心水平27℃時，激活時間和Ca2+離子終濃度對凝血酶活力的交互作用。當(dāng)激活時間不變時，隨著Ca2+離子終濃度的增大，凝血酶的活力呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；當(dāng)固定Ca2+離子終濃度不變時，凝血酶的活力隨著激活時間的延長也呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；激活時間和Ca2+離子終濃度在1.5～2.5h、0.007～0.012mol/L之間時，凝血酶活力有最大值。

2.4 響應(yīng)面工藝的驗證

本實驗優(yōu)化得出激活牦牛凝血酶原的最佳工藝條件為：激活溫度26.82℃、Ca2+離子終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h，凝血酶活力的理論值為63.5811U/mg，考慮到實際操作的可行性，將凝血酶原的激活工藝優(yōu)化為激活溫度27℃、Ca2+離子終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h。按上述條件進(jìn)行驗證實驗，測定凝血酶的活力為63.3972U/mg，酶活與預(yù)測值之間的相對誤差為0.3%。證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化的牦牛凝血酶原的激活工藝模型可行。

3 結(jié)論

通過Box-Behnken實驗設(shè)計，優(yōu)化Ca2+離子激活牦牛血中凝血酶原的最佳工藝條件為：激活溫度27℃、Ca2+離子終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h。在上述條件下，凝血酶活力的實驗值為63.3972U/mg，酶活與預(yù)測值之間的相對誤差為0.3%，各因素對凝血酶活力的影響依次為：激活溫度＞激活時間＞Ca2+終濃度。通過對回歸模型進(jìn)行方差分析和交互作用分析，得知該回歸模型極顯著，對實驗擬合較好。因此，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的參數(shù)具有一定的實用價值。

[1]Carminita Frost，Ryno Naude，Willem Oelofsen，et al. Purification and characterization of ostrich prothrombin[J].The International Journal of Biochemistry＆Cell Biology，2000（32）：1151-1159.

[2]Girolami A，Scarparo P，Bonamigo E，et al.Homozygous FVII deficiencies with different reactivity towards tissue thromboplastins of different origin[J].Hematology，2012，17（6）：350-354.

[3]Lovgren A.Recombinant snake venom prothrombin activators [J].Bioengineered，2013，4（3）：153-157.

[4]幸春艷，陳英珠，吳萌，等.Ca2+離子激活凝血酶原作用初步研究[J].河北省科學(xué)院學(xué)報，2001，18（3）：172.

[5]劉湘新，何湘容，劉進(jìn)輝，等.凝血酶的制備工藝研究及其活性測定[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005（4）：32-34.

[6]南學(xué)梅，董文賓.豬血制品的研制與開發(fā)[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010（B8）：288-292.

[7]楊明俊，吳婧，李志忠，等.羊血漿中凝血酶的提取工藝及穩(wěn)定性研究[J].中國食品工業(yè)，2010（3）：53.

[8]朱天新，袁彩君，任晚瓊.牛血凝血酶的制備工藝[J].中國生化藥物雜志，2007（3）：185-188.

[9]郭憲，閻萍.中國牦牛遺傳資源現(xiàn)狀分析[J].中國畜禽種業(yè)，2008（1）：60-62.

[10]金晶，張珍，張麗，等.低溫?zé)o水乙醇沉淀法提取牦牛血免疫球蛋白的工藝條件研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，45（4）：51-54.

[11]趙文寶，張珍，郭建華，等.牦牛血中超氧化物歧化酶提取工藝研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，45（1）：147-150.

[12]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2002：42-46.

[13]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].等二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1149.

[14]周文靜，呂嘉櫪.豬血中提取純化凝血酶方法改進(jìn)[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（2）：93-95.

[15]李敏康，錢冬明，任宏媛，等.豬血漿中多種功能蛋白的連續(xù)提取[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2007，23（6）：242-245.

[16]謝萬如，左勇.凝血酶活力影響因素的初步研究[J].四川理工學(xué)院學(xué)報，2004，17（3）：147-150.

Study on optimization of Ca2+on activation of prothrombin process conditions in yak blood by response surface method

ZHANG Yang1，ZHANG Zhen1，*，ZHANG Sheng-gui1，NIU Li-li1，DU Yu1，ZHOU Yun2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.The Quality&Technical Supervision Bureau Of Huachi，Qingyang 745600，China）

Yak blood as the research object，the prothrombin was prepared by adsorption method with barium citrate.The study optimized preparation conditions of Ca2+activating the prothrombin in yak blood by single factor experiment（the activating temperature，final concentration of Ca2+and activating time）and Box-Behnken experiment.The results showed that the optimal thrombin specific activity was 63.3972U/mg at the following conditions：activating temperature 27℃，final concentration of Ca2+0.01mol/L，activating time 1.95h.

activating by Ca2+；prothrombin；yak；adsorption with barium citrate；response surface experiments

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0293-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.056

2013－10－23 *通訊聯(lián)系人

張陽（1987-），男，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

國家科技部支撐計劃項目（2007BAD52B07）；甘肅省科技廳自然基金（1107RGZA123）。