趙有璽，龔 平，羅忠智，冀頤之（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023）

原生質(zhì)體激光誘變選育假白布勒彈孢酵母輔酶Q10高產(chǎn)菌株

趙有璽，龔 平，羅忠智，冀頤之*
（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023）

對一株產(chǎn)輔酶Q10的菌株假白布勒彈孢酵母BUQ-3進(jìn)行了原生質(zhì)體制備、再生及激光誘變育種的研究。結(jié)果顯示假白布勒彈孢酵母BUQ-3原生質(zhì)體形成及再生的最佳條件為：菌齡26h，蝸牛酶濃度2g/L，酶溶液pH7.5，酶解溫度25℃，酶解時(shí)間1.5h。He-Ne激光誘變的最佳誘變時(shí)間為4.5min。以色素突變型為篩選模型，經(jīng)激光誘變，獲得具有遺傳穩(wěn)定特性的高產(chǎn)突變株BUQJ-012，其輔酶Q10產(chǎn)量比親本株提高了87%，達(dá)到1.53mg/L。

假白布勒彈孢酵母，輔酶Q10，原生質(zhì)體，激光，誘變選育

輔酶Q10（CoQ10）是一種存在于動(dòng)、植物及微生物中的脂溶性醌類化合物，具有細(xì)胞抗氧化[1]、阻止細(xì)胞凋亡[2]、輔助線粒體膜質(zhì)子梯度解偶聯(lián)[3]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的消炎功能[4]等重要的生理作用，廣泛的應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域[5-7]。

輔酶Q10可由動(dòng)植物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法三種生產(chǎn)方法獲得[8]，其中利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10具有原料成本低、無光學(xué)異構(gòu)體，生物學(xué)活性高，臨床應(yīng)用效果好，可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)勢，目前已成為最具發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q10生產(chǎn)方法[9]。然而，微生物發(fā)酵法中存在的最大問題是：發(fā)酵菌株普遍不能積累高水平輔酶Q10、發(fā)酵產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高[10]。通過從自然界中篩選高產(chǎn)輔酶Q10菌株，并對其代謝途徑進(jìn)行研究，通過誘變育種和基因工程手段提高菌株的產(chǎn)量成為目前研究的熱點(diǎn)[11-12]。由于輔酶Q10合成途徑復(fù)雜，基因工程高產(chǎn)菌株的構(gòu)建至今尚未取得突破性進(jìn)展[13]。因此，采用傳統(tǒng)的物理或化學(xué)方法進(jìn)行誘變育種，仍是提高輔酶Q10產(chǎn)量較為有效的途徑[14]。

原生質(zhì)體激光誘變技術(shù)是一種重要的工業(yè)微生物育種技術(shù)。原生質(zhì)體因失去了細(xì)胞壁的保護(hù)而對外界刺激更為敏感，從而更易顯現(xiàn)誘變的生物學(xué)效應(yīng)，有利于高產(chǎn)菌株篩選。激光誘變技術(shù)是一種新型的誘變技術(shù)，在微生物誘變研究上取得了較好的結(jié)果[15]。目前，利用原生質(zhì)體激光誘變技術(shù)選育高產(chǎn)輔酶Q10菌株的研究還未見報(bào)道。本文探討了假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體制備及再生條件，并對原生質(zhì)體激光誘變條件進(jìn)行了研究，以表型效應(yīng)-色素突變株作為輔酶Q10高產(chǎn)菌的篩選模型進(jìn)行篩選，以期為輔酶Q10的原生質(zhì)體激光育種工作提供一定的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

假白布勒彈孢酵母（Bullera pseudoalba）BUQ-3本實(shí)驗(yàn)室保藏；CoQ10標(biāo)準(zhǔn)樣品 Sigma公司；蝸牛酶、β-巰基乙醇 北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；EDTA·Na2北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Tris 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；焦性沒食子酸 廣西汕頭市西隴化工廠。

SJ-8型He-Ne激光器 河北迪生醫(yī)療器械有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；5810R型高速離心機(jī) eppendorf；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母浸粉5，蛋白胨10，pH6.0。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母浸粉5，蛋白胨5，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.3，pH自然。

1.2.3 再生培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母浸粉5，蛋白胨10，蔗糖100，瓊脂粉20，pH6.0。

1.3 試劑制備

1.3.1 0.5mol/L EDTA溶液 在800mL水中加入186.1g EDTA-Na2·2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0，然后定容至1L。

1.3.2 ST溶液 蔗糖171.15g/L，MgCl2·6H2O 2.03g/L，Tris 1.21g/L，用0.1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH，滅菌后備用。1.3.3 STC溶液 ST溶液中加入CaCl21.11g/L，滅菌后備用。

1.3.4 蝸牛酶液 按一定比例將蝸牛酶溶于10mL ST溶液中，并用微孔濾膜過濾除菌。

1.3.5 前處理液 10mL 0.05mol/L EDTA溶液中加入14滋L β-巰基乙醇。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 搖瓶培養(yǎng) 將假白布勒彈孢酵母斜面菌種取一環(huán)接種至種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶裝50mL，27℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)1d。然后再將其轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶裝50mL，接種量5%，27℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)2d。

1.4.2 輔酶Q10的提取 10000r/min，10min離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，采用皂化法[16]進(jìn)行輔酶Q10提取。

1.4.3 紫外分光光度法測定輔酶Q10含量

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取1mg輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇定容至100mL，配成質(zhì)量濃度為10滋g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10mL，在輔酶Q10最大吸收波長275nm處測定其吸光度值。

1.4.3.2 輔酶Q10質(zhì)量濃度的測定 在275nm處測定輔酶Q10提取液的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的輔酶Q10含量。

1.4.4 生長曲線的測定 按方法1.4.1進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間取樣，菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以空白培養(yǎng)基為對照，在560nm下測定其吸光度，并根據(jù)吸光度繪制假白布勒彈孢酵母生長曲線。

1.4.5 原生質(zhì)體的制備與再生 3500r/min離心10min收集培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體，生理鹽水離心洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于10mL前處理溶液中，恒溫水浴30℃振蕩處理10min。前處理后菌液適當(dāng)稀釋，涂布平板，記錄細(xì)胞菌落數(shù)A。將前處理后的菌液3500r/min離心10min收集菌體。方法同前面描述，將菌體懸浮于一定濃度和pH的蝸牛酶溶液中，水浴振蕩進(jìn)行酶解。酶解后3000r/min離心10min收集細(xì)胞備用。一組酶解細(xì)胞，用ST溶液離心洗滌后重懸于ST溶液中，經(jīng)無菌水適當(dāng)稀釋后，涂布于固體培養(yǎng)基平板上，27℃培養(yǎng)2～3d，待菌落形成后，記錄未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)B，計(jì)算原生質(zhì)體形成率，見式（1）。另一組酶解細(xì)胞，用STC溶液離心洗滌后重懸于STC溶液中，STC溶液適當(dāng)稀釋后，取0.1mL稀釋液加入45～50℃再生培養(yǎng)基軟瓊脂中，搖勻后迅速倒入再生固體培養(yǎng)基平板上，27℃倒置培養(yǎng)2～3d，形成菌落即為原生質(zhì)體再生菌落及未形成原生質(zhì)體的菌落之和C。計(jì)算原生質(zhì)體的再生率，見式（2）。

1.4.6 原生質(zhì)體的制備與再生條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.4.6.1 不同酶濃度實(shí)驗(yàn) 將前處理后的菌體分別懸浮于濃度為0.5、1、1.5、2、2.5g/L的蝸牛酶溶液中，pH7，30℃水浴振蕩，酶解1h。酶解后，進(jìn)行原生質(zhì)體的再生，并計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.6.2 不同酶溶液pH實(shí)驗(yàn) 將前處理后的菌體分別懸浮于酶溶液pH為6.0、6.5、7.0、7.5的2g/L的蝸牛酶溶液中，30℃水浴振蕩，酶解1h。酶解后，進(jìn)行原生質(zhì)體的再生，并計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.6.3 不同酶解溫度實(shí)驗(yàn) 將前處理后的菌體懸浮于2g/L的蝸牛酶溶液中，pH7.5，水浴溫度20、25、30、35℃，振蕩酶解1h。酶解后，進(jìn)行原生質(zhì)體的再生，并計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.6.4 不同酶解時(shí)間實(shí)驗(yàn) 將前處理后的菌體懸浮于2g/L的蝸牛酶溶液中，pH7.5，25℃水浴振蕩，酶解時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h。酶解后，進(jìn)行原生質(zhì)體的再生，并計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.7 He-Ne激光誘變時(shí)間的確定 開啟He-Ne激光，將功率調(diào)節(jié)至12W，預(yù)熱30min后，將裝有200滋L假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體懸液的試管垂直置于激光照射鏡頭上，進(jìn)行激光誘變，誘變時(shí)間分別為：1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0min。誘變后，進(jìn)行原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)，計(jì)算致死率，見式（3）。

其中，D為未誘變對照組在再生平板上的菌落，E為激光誘變組在再生平板上的菌落數(shù)。

1.4.8 激光誘變及突變株的篩選 在最佳誘變時(shí)間下對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體進(jìn)行He-Ne激光誘變。誘變后進(jìn)行原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)，觀察再生菌落的顏色變化，選擇顏色發(fā)生變化的菌落，即色素突變型作為初篩對象，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，提取胞內(nèi)輔酶Q10并進(jìn)行含量的檢測。

1.4.9 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將復(fù)篩獲得的高產(chǎn)菌株斜面?zhèn)?0代，考察其菌落顏色變化情況，同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測胞內(nèi)輔酶Q10含量，以確定其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照方法1.4.3，根據(jù)不同質(zhì)量濃度的輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)溶液在275nm處的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。其線性回歸方程為y=0.47958x+0.01602，相關(guān)系數(shù)為R2=0.99919。

圖1 輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of coenzyme Q10

2.2 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的制備

2.2.1 制備原生質(zhì)體最佳菌齡的確定 由圖2可知，假白布勒彈孢酵母0～4h為其延滯期，菌體生長處于靜止?fàn)顟B(tài)，菌數(shù)增幅較小，此期菌體正在合成生長所需酶類；4～26h菌體生長旺盛，OD值呈指數(shù)增加，此期為菌體對數(shù)生長期；26～50h OD值在一定范圍趨于平穩(wěn)，菌體達(dá)到穩(wěn)定期；50h后生長曲線呈迅速下降趨勢，菌體進(jìn)入衰亡期。

制備原生質(zhì)體時(shí)，處于不同生長時(shí)期的菌體，對各種溶壁酶的敏感性不同，菌齡過短，可制備原生質(zhì)體菌量過少，原生質(zhì)體形成率較低；菌齡過大，酶解效果較差，不宜形成原生質(zhì)體。本實(shí)驗(yàn)選擇假白布勒彈孢酵母菌體對數(shù)期中后期，菌齡為26h的菌體進(jìn)行原生質(zhì)體制備，此時(shí)菌體生長旺盛，菌量多，對溶壁酶較敏感，易形成原生質(zhì)體。

圖2 假白布勒彈孢酵母的生長曲線Fig.2 Growth curve of Bullera pseudoalba

2.2.2 酶濃度對原生質(zhì)體制備及再生的影響 考察不同濃度蝸牛酶對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體形成及再生的影響，結(jié)果如圖3所示。假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的形成率隨酶濃度的增大而逐漸升高，蝸牛酶酶濃度為2g/L時(shí)，其原生質(zhì)體的形成率最高，可達(dá)到25.53%。而再生率卻隨著酶濃度的升高變化不大，基本處于21%～22%之間。綜合考慮原生質(zhì)體的形成率和再生率，確定2g/L蝸牛酶濃度為最佳酶解濃度。

圖3 酶濃度對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.3 Effect of snail enzyme content on protoplast preparation and regeneration

2.2.3 pH對原生質(zhì)體制備及再生的影響 考察pH對原生質(zhì)體制備及再生的影響。結(jié)果如圖4所示，假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的形成率是隨pH變化呈拋物線狀，酶溶液pH為7.0時(shí)原生質(zhì)體的形成率最高，達(dá)到22.79%，pH為6.5和7.5時(shí)形成率相近，分別為20.69%和20.41%；pH為6.0時(shí)，形成率最低為19.72%。而假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的再生率卻在pH7.5時(shí)最高，達(dá)到23.33%。分析原因可能是pH為7時(shí)，酶解作用較強(qiáng)，原生質(zhì)數(shù)形成率較高。但此時(shí)細(xì)胞脫壁太徹底，失去了細(xì)胞壁再生的基礎(chǔ)，因此導(dǎo)致了較低的再生率。綜合考慮原生質(zhì)體形成率和再生率，選擇兩者乘積最大值的pH7.5為最佳酶解條件。

圖4 酶溶液pH對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.4 Effect of enzyme system pH on protoplast preparation and regeneration

2.2.4 酶解溫度對原生質(zhì)體制備及再生的影響 考察了不同溫度對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體制備及再生的影響。結(jié)果如圖5所示，酶解溫度為25℃和30℃時(shí)原生質(zhì)體的形成率較高，分別達(dá)到22.7%和22.97%。酶解溫度為20℃和35℃時(shí)，原生質(zhì)體的形成率卻有所下降，在20%左右。原生質(zhì)體的再生率在35℃時(shí)最高，為23.33%。分析原因可能是因?yàn)?5～30℃為酶解的最適溫度，因此酶解更徹底，形成的原生質(zhì)體數(shù)較多。但同樣最適的酶解作用對原生質(zhì)體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞較大，從而導(dǎo)致了較低的再生率。綜合考慮原生質(zhì)體形成率和再生率，選擇25℃為最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on protoplast preparation and regeneration

2.2.5 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體制備及再生的影響 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體制備的質(zhì)量和產(chǎn)量是較為重要的因素，酶解時(shí)間過短，原生質(zhì)體形成不完全，酶解時(shí)間過長，對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致原生質(zhì)體的再生率下降。不同酶解時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的形成率是隨酶解時(shí)間的增加呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，酶解3.5h時(shí)其原生質(zhì)體形成率達(dá)到最大值26.7%。原生質(zhì)體的再生率隨著酶解時(shí)間的延長而出現(xiàn)緩慢下降的趨勢?；诩骖櫾|(zhì)體的形成率和再生率的原則，選擇1.5h為其最佳酶解時(shí)間，此條件下原生質(zhì)體的形成率為25.6%，再生率為22.8%。

圖6 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on protoplast preparation and regeneration

2.3 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體激光誘變

2.3.1 He-Ne激光誘變時(shí)間的確定 選擇不同誘變時(shí)間對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體進(jìn)行He-Ne激光誘變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。通常認(rèn)為宜選擇致死率在70%～80%的誘變劑量，在此劑量范圍內(nèi)，雖產(chǎn)量提高幅度較小，但正突變幾率較大。He-Ne激光誘變工作劑量為4.5min時(shí)假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的致死率為77%，因此確定4.5min為He-Ne激光誘變最佳誘變時(shí)間。

圖7 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體激光誘變致死率Fig.7 The mortality rate of the protoplast of Bullera pseudoalba induced by He-Ne laser

2.3.2 He-Ne激光誘變及突變株篩選 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體經(jīng)He-Ne激光誘變后，獲得色素突變菌株31株。搖瓶復(fù)篩測定其胞內(nèi)輔酶Q10含量，獲得4株輔酶Q10高產(chǎn)突變菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，其中突變菌株BUQJ-012胞內(nèi)輔酶Q10含量最高，達(dá)到1.53mg/L，較出發(fā)菌株BUQ-3提高了87%。分析原因可能是由于激光輻照使親本株代謝途徑發(fā)生改變[17-18]。輔酶Q10和類胡蘿卜素的微生物合成途徑中都存在一個(gè)相同的聚異戊二稀長鏈的合成途徑，因此理論上若誘變使胡蘿卜素和輔酶Q10相同合成途徑中的前體物質(zhì)增加，則可促進(jìn)兩者產(chǎn)量的增加；而若能阻斷兩者相同合成途徑后的胡蘿卜素的合成途徑的物質(zhì)的生成，則也能對輔酶Q10的合成產(chǎn)生積極的影響[19]。代謝途徑的改變直接導(dǎo)致色素產(chǎn)物積累量的變化，表觀則表現(xiàn)為菌落顏色的改變。本實(shí)驗(yàn)野生菌株呈深黃色，激光誘變之后可獲得紅色、粉色、橙色、白色等色素突變株，所獲得的輔酶Q10高產(chǎn)突變菌株BUQJ-012為橙色突變株。

表1 突變株輔酶Q10產(chǎn)量Table 1 The coenzyme Q10production of mutant

2.3.3 遺傳穩(wěn)定性研究 選擇突變菌株BUQJ-012進(jìn)行遺傳穩(wěn)定型實(shí)驗(yàn)，將BUQJ-012連續(xù)傳代10次，分別測定其胞內(nèi)輔酶Q10含量，考察突變株的穩(wěn)定性。所得結(jié)果如表2所示，突變株BUQJ-012胞內(nèi)輔酶Q10含量維持在1.53mg/L左右，菌體形態(tài)未發(fā)生變異，表明He-Ne激光誘變所獲得的高產(chǎn)突變株BUQJ-012具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究對輔酶Q10生產(chǎn)菌株假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行了優(yōu)化。選擇26h為假白布勒彈孢酵母菌體進(jìn)行原生質(zhì)體制備的最佳菌齡；蝸牛酶濃度2g/L，酶溶液pH7.5，酶解溫度25℃，酶解時(shí)間1.5h為最優(yōu)酶解條件。為制備大量的假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體以用于其菌種性能的改造奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Breeding of the coenzyme Q10producing strain Bullera pseudoalba by laser induced protoplast mutagenesis

ZHAO You-xi，GONG Ping，LUO Zhong-zhi，JI Yi-zhi*
（Biochemical Engineering College，Beijing Union University，Beijing 100023，China）

The conditions of protoplast formation，regeneration and laser mutagenesis of Bullera pseudoalba BUQ-3strain were studied.As a result，the optimal conditions for protoplast preparation and regeneration of Bullera pseudoalba BUQ-3strain were showed as follows：26h of cell growth time，the content of snail enzyme was 2g/L，the pH of enzyme system was 7.5，enzymolysis temperature was 25℃，enzymolysis time was 1.5h. The optimal time of Laser induced was 4.5min.The coenzyme Q10high yield mutant strain with good genetic stability，numbered BUQJ-012，was obtained based on pigment mutants.Its coenzyme Q10yield was up to 1.53mg/L，which was 87%higher than that of the parent strain.

Bullera pseudoalba；coenzyme Q10；protoplast；laser；mutation breeding

TS201.2

A

1002-0306（2014）14-0230-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.042

2014－04－18 *通訊聯(lián)系人

趙有璽（1979-），男，碩士研究生，講師，主要從事工業(yè)微生物方面的研究。

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目（2012D005022000007）；啟明星大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（201411417SJ085）。