王 莉，趙 樺，馬英麗，王 星（陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723000）

響應面法優(yōu)化小叢紅景天多糖超聲提取工藝研究

王 莉，趙 樺*，馬英麗，王 星
（陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723000）

為優(yōu)化小叢紅景天藥材中水溶性多糖超聲提取工藝，在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析方法建立了小叢紅景天多糖超聲提取的二次響應曲面方程。實驗證實提取溫度、超聲功率、提取時間和料液比對小叢紅景天多糖提取有不同的影響。結(jié)果表明，在實驗范圍內(nèi)通過方差分析可知各因素對小叢紅景天多糖提取率影響的大小依次為超聲提取溫度、超聲功率、料液比和超聲提取時間。小叢紅景天多糖超聲提取工藝的最佳條件為：提取溫度69℃、超聲功率240W、料液比1∶30（g/mL），提取時間39min，在此條件下小叢紅景天多糖提取率可達4.305%，與模型預測值高度相符。

小叢紅景天，多糖，超聲提取，響應面分析法

小叢紅景天（Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H. Fu），又名鳳尾七、霧靈景天，系景天科多年生紅景天屬植物。紅景天屬植物在世界上有90余種，多分布在北半球的高寒地帶，大多數(shù)都生長在海拔3500～5000m左右的高山流石或灌木叢林下，中國有73種2亞種7變種。主要分布在我國東北、華北、內(nèi)蒙古、西北、西南、華中的神農(nóng)架等地區(qū)[1]，屬于天然珍貴藥用植物，素有“高原人參”和“雪山仙草”之稱，是陜西地道的藥材“七藥”之一[2-3]，具有滋陰補腎、養(yǎng)心安神、調(diào)經(jīng)活血及明目等功效[2-3]?，F(xiàn)代藥學和藥理學研究表明，小叢紅景天的主要活性成分為黃酮、酚類、揮發(fā)油和微量元素等，具有延緩機體衰老、清除自由基、增強記憶、改善睡眠、防治老年疾病等功效，在軍事醫(yī)學、運動醫(yī)學和保健醫(yī)學等方面都具有廣泛的應用[4-6]。小叢紅景天藥材含有一定量的多糖類化合物，我們已對其含量以及體外抗氧化、抑菌殺菌生物學活性進行了初步分析研究，研究結(jié)果表明小叢紅景天多糖具有良好的體外抗氧化活性和抗菌抑菌活性，具有一定的開發(fā)和應用價值[7]。然而，目前有關小叢紅景天多糖提取工藝的研究還未見報道。

近年來，現(xiàn)代提取技術(shù)超聲提取法具有設備簡單、操作時間短、提取效率高等優(yōu)點，已廣泛用于天然產(chǎn)物中有效成分的提取[8-11]。響應面分析法（Response surface analysis，RSA）是利用合理的實驗設計，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，以回歸分析尋求最優(yōu)工藝的有效方法。目前，該分析法已經(jīng)廣泛應用在諸多工藝過程優(yōu)化控制等領域[8-17]。本文以秦巴山區(qū)產(chǎn)小叢紅景天植物為材料，采用微波輔助提取法，通過不同提取單因素實驗，分析比較提取分離過程中各因素對多糖提取的影響，利用響應面分析法優(yōu)化其多糖類化合物提取工藝。研究結(jié)果將豐富對小叢紅景天藥材的應用研究積累研究資料，同時也為小叢紅景天植物資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小叢紅景天藥材 購自漢中藥材市場，經(jīng)漢中藥檢所彭強主任藥師鑒定為景天科紅景天屬小叢紅景天，實驗材料用清水洗凈，于50℃烘至恒重，粉碎過24目篩，密封保存。

UV-2550型紫外分光光度計 日本島津；MS204-S型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；IKARV 10D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小叢紅景天中多糖提取的工藝流程 50℃烘干藥材→粉碎過24目篩→45℃乙醚索氏提取脫脂至乙醚為無色，藥渣揮干乙醚，置于圓底燒瓶中→95%乙醇回流提取90℃回流2h（去除單糖、低聚糖、苷類及生物堿等干擾成分）→抽濾→所得濾渣按一定液料比加蒸餾水→超聲波浸提（按一定的超聲波功率、超聲波提取溫度、超聲波提取時間、提取次數(shù)浸提）→抽濾→濾液水浴濃縮→加入乙醇，使乙醇含量達到80%以上，直到不再產(chǎn)生新的沉淀為止，靜置過夜→抽濾，回收乙醇→所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌→揮干溶劑后，50℃烘干，得到粗多糖→UV檢測。

1.2.2 小叢紅景天多糖含量測定 采用蒽酮—硫酸法測定小叢紅景天植物中多糖含量[18]。

1.2.2.1 標準曲線的建立 精密稱取烘至恒重的無水葡萄糖25mg，置于500mL容量瓶中，用無離子水溶解并定容至刻度，即配成50μg/mL的標準溶液。

分別精密吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL儲備液置于試管中，加入1mL蒸餾水，再分別加入10mL 2g/mL的蒽酮-硫酸試劑（冰水浴中），搖勻，沸水浴15min，取出后于冰水浴中冷卻至室溫。在620nm處測吸光度[17]，以吸光度A為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為：A=0.0032C+ 0.0008（R2=0.9995）。其濃度在20.00～100.00μg/mL范圍內(nèi)，線性關系良好。

1.2.2.2 樣品制備 按1.2.1項下，稱取小叢紅景天藥材粉末10.00g，提取小叢紅景天粗多糖。

1.2.2.3 小叢紅景天多糖含量檢測 精密稱取粗多糖粉末10mg，于100mL容量瓶中，用無離子水溶解并定容至刻度。精密吸取1mL于試管中，參照1.2.1同樣顯色操作處理，測定吸光值A。根據(jù)葡萄糖標準曲線可計算小叢紅景天多糖的濃度C（小叢紅景天多糖濃度以葡萄糖濃度計）和提取率。

式中：C為樣品液中多糖的質(zhì)量濃度（μg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品液的體積（mL）；M為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素實驗 準確稱取小叢紅景天粉末10.00g，在其他條件相同的情況下，采用不同液料比、超聲功率、超聲提取時間、超聲提取溫度和超聲提取次數(shù)進行超聲輔助提取，以小叢紅景天多糖提取率為響應值，逐個考察各提取條件對提取效果的影響。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗結(jié)果的基礎上，采用響應面分析法，根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理[11]，固定超聲提取次數(shù)為2次，選取料液比X1、超聲功率X2、提取時間X3、提取溫度X4共4個對多糖的提取影響顯著的因素，以小叢紅景天多糖提取率為響應值，采用4因素3水平的響應面分析法，得到二次回歸方程，以確定小叢紅景天多糖的最佳工藝條件并進行驗證。實驗設計如表1所示。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Variables and levels in response surface design

所有的實驗均重復3次，利用統(tǒng)計分析軟件Design Expert 8.0及Excel程序?qū)嶒灲Y(jié)果進行分析。

圖1 料液比對小叢紅景天多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對小叢紅景天多糖提取率的影響 精密稱取小叢紅景天粉末10.00g，按提取溫度為70℃，提取時間為30min，超聲波輸出功率為210W，超聲波提取次數(shù)為2次的條件下，分別將料液比設為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40這五個水平，每個水平做三個重復實驗，以考察料液比對小叢紅景天多糖提取率的影響。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，多糖提取率隨著料液比的改變而變化，在1∶20～1∶30（g/mL）的范圍內(nèi)尤為明顯。當料液比達到1∶30后，隨著料液比的繼續(xù)增大，多糖提取率遞增的趨勢不明顯。液料比越大，多糖提取率越高，其原因是提取液體積越大，溶劑與浸提物的接觸越充分，能在相同時間內(nèi)溶解出更多的水溶性多糖，使提取率增大。當溶液量繼續(xù)增加，料液比達1∶30后，曲線趨于平緩，說明多糖溶解基本飽和。如果液料比過小，就沒有足夠的溶劑帶出藥材顆粒中的多糖，從而使提取率降低。如果料液比過大，會消耗更多的能量和時間，同時也會增加超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降，從而降低有效成分的提取率，因此液料比為1∶30（g/mL）較適宜。

2.1.2 超聲功率對小叢紅景天多糖提取率的影響 精密稱取小叢紅景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取時間為30min，提取溫度為70℃，超聲波提取次數(shù)為2次的條件下，分別將超聲功率設為150、180、210、240、270W這五個水平，每個水平做三個重復實驗，以考察超聲功率對小叢紅景天多糖提取率的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲功率對小叢紅景天多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由圖2可知，在超聲波功率150～240W范圍內(nèi)，小叢紅景天多糖提取率隨著超聲波功率的增大而提高，這是因為隨著功率的增加，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，胞內(nèi)多糖溶出速率增大，溶液中多糖的含量也逐漸增加。在240～270W之間，隨著超聲波功率的增大，多糖提取率下降，其主要原因是當超聲功率大于240W時，超聲作用進一步加速了提取液的流動，從而減少了物料在超聲場中的停留時間，破壁作用也隨之減弱，同時功率過大可能會使多糖分子降解程度加大。因此，選擇超聲波功率為240W左右為宜。

2.1.3 超聲提取時間對小叢紅景天多糖提取率的影響 精密稱取小叢紅景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取溫度為70℃，超聲波輸出功率為210W，超聲波提取次數(shù)為2次的條件下，分別將提取時間設為10、20、30、40、50min這五個水平，每個水平做三個重復實驗，以考察超聲提取時間對小叢紅景天多糖提取率的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲提取時間對小叢紅景天多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由圖3可知，在超聲時間低于40min時小叢紅景天多糖提取率提高比較明顯，以后增加趨于平緩。這表明，小叢紅景天多糖浸出過程與時間密切相關，時間過短，產(chǎn)物溶解不充分，多糖提取率較低，但隨著提取時間超過40min時后，多糖提取率不再提高。這是因為超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間的作用會使大分子的多糖斷裂，從而在后處理的過程中損失增大而影響多糖的提取率。因此，選擇超聲提取時間為40min左右為宜。

2.1.4 超聲提取溫度對小叢紅景天多糖提取率的影響 精密稱取小叢紅景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取時間為30min，超聲波輸出功率為210W，超聲波提取次數(shù)為2次的條件下，分別將提取溫度設為40、50、60、70、80℃這五個水平，每個水平做三個重復實驗，以考察超聲提取溫度對小叢紅景天多糖提取率的影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲提取溫度對小叢紅景天多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由圖4可知，在40～70℃之間，小叢紅景天多糖提取率隨提取溫度的升高不斷提高，達到70℃時，多糖提取率達到最高，超過70℃后多糖的提取率開始降低。這可能是因為溫度過低時，多糖不能有效地溶出；提取溫度升高會加快溶液的擴散速率，促進細胞內(nèi)的多糖物質(zhì)向外擴散。而溫度太高，則部分多糖降解，提取率隨之降低。因此，選擇超聲提取溫度為70℃左右為宜。

2.1.5 提取次數(shù)對小叢紅景天多糖提取率的影響 精密稱取小叢紅景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取時間為30min，提取溫度為70℃，超聲波輸出功率為210W的條件下，分別將提取次數(shù)設為1、2、3、4、5次這五個水平，每個水平做三個重復實驗，以考察提取次數(shù)對小叢紅景天多糖提取率的影響。結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲提取次數(shù)對小叢紅景天多糖提取率的影響Fig.5 Effect of the number of repeated extraction on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由圖5可知，隨著超聲提取次數(shù)的增加，多糖提取率也隨之不斷提高。在第3、4、5次提取率的變化不明顯，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，且次數(shù)對多糖提取率影響不大，故最佳提取次數(shù)選為2次。

2.2 響應面實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.2.1 二次回歸模型擬合及方差分析 由Design Expert 8.0統(tǒng)計分析軟件的實驗設計功能可知，四因素二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設計包括29個實驗方案，具體實驗方案及實驗結(jié)果如表2所示。表中1～24號是析因?qū)嶒灒?5～29號是中心實驗。29個實驗點為分析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計實驗誤差。

用軟件Design Expert 8.0對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表3。對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

Y（%）=-98.05503+0.26602X3+0.34279X2+ 1.36860X4+0.51797X1+0.00067X3X2-0.00018X3X4-0.00028X1X3-0.00087X2X4+0.00036X2X1-0.00066X42-0.00506X32-0.00066X22-0.00821X42-0.00885X12。

從表3可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應值的關系時，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著（r=模型平方和/總離差平方和=0.9763），模型的顯著水平p＜0.0001，說明此模型高度顯著，與實際實驗擬合良好，實驗誤差小，該實驗方法可靠?；貧w方程各項方差分析，當顯著水平p＜0.05時，它所對應的條件對響應值的作用是顯著的，方程的失擬誤差不顯著，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。結(jié)果表明，料液比（X1）、超聲功率（X2）、提取溫度（X4）、超聲功率與提取時間相互作用（X2X3）、超聲功率與提取溫度相互作用（X2X4）、料液比二次項（X12）、超聲時間二次項（X22）、提取時間二次項（X32）、提取溫度二次項（X42）對實驗結(jié)果影響顯著。因此，各實驗因子對響應值的影響不是線性關系。對小叢紅景天多糖提取率影響的大小依次為超聲提取溫度＞超聲功率＞料液比＞超聲提取時間，即超聲提取溫度對小叢紅景天多糖提取率的影響最為顯著。

表2 響應面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

2.2.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化 RSM方法的圖形是特定的響應面Y對應的因素料液比（X1）、超聲功率（X2）、提取時間（X3）、提取溫度（X4）構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素對響應值的影響，從實驗所得的響應面分析圖上可以找到它們在反應過程中的相互作用。回歸優(yōu)化響應面曲面圖見圖6～圖11。

響應曲面圖表現(xiàn)為曲線越陡，則說明該因素對多糖提取率的影響越顯著。而其表現(xiàn)為曲線平滑，則說明影響不顯著，并且隨其數(shù)值的增加或減少，響應值變化較小。因此，由圖6～圖11可知，超聲提取溫度（X4）對小叢紅景天多糖提取的影響最顯著，超聲功率（X2）次之，最后為料液比（X1）和超聲提取時間（X3）；超聲提取時間（X3）與超聲功率（X2）交互作用顯著、超聲提取時間（X2）與超聲提取溫度（X4）交互作用顯著、超聲提取時間（X4）與料液比（X1）交互作用不顯著、超聲提取溫度（X4）與超聲功率（X3）交互作用不顯著、料液比（X1）與超聲功率（X2）交互作用不顯著、料液比（X1）與超聲提取溫度（X3）交互作用不顯著，與表3中交互項p值的分析結(jié)果一致。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANONA（analysis of variance）of tems of regression equation

圖6 提取時間與超聲功率對多糖提取率的影響Fig.6 Response surface plot of the effects of extraction time and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

圖7 提取時間與提取溫度對多糖提取率的影響Fig.7 Response surface plot of the effects of extraction time and extraction temperature on extraction yield of polysaccharides

圖8 提取時間與料液比對多糖提取率的影響Fig.8 Response surface plot of the effects of extraction time and solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharides

圖9 提取溫度與超聲功率對多糖提取率的影響Fig.9 Response surface plot of the effects of extraction temperature and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

2.3 驗證實驗

回歸模型預測的小叢紅景天多糖提取最佳工藝條件為：提取溫度68.84℃、超聲功率244.05W、料液比1∶31.04，提取時間40.07min，在此條件下小叢紅景天多糖提取率可達4.30939%?？紤]到實際操作，將最佳工藝修正為提取溫度69℃、超聲功率240W、料液比1∶30，提取2次，每次39min。在此條件下稱取小叢紅景天干燥粉末3份，進行三組驗證性實驗。驗證實驗結(jié)果見表4。

圖10 料液比與超聲功率對多糖提取率的影響Fig.10 Response surface plot of the effects of water/material ratio and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

表4 驗證實驗結(jié)果（n=3）Table 4 Experimental results of verification（n=3）

由表4可知，實際測得小叢紅景天多糖平均提取率為4.305%，與模型預測值高度相符。

3 結(jié)論

各因素對小叢紅景天多糖提取率影響的大小依次為超聲提取溫度、超聲功率、料液比和超聲提取時間，即超聲提取溫度對小叢紅景天多糖提取率的影響最為顯著。

通過響應面法優(yōu)化得到小叢紅景天多糖的超聲輔助提取最優(yōu)工藝條件為提取溫度69℃、超聲功率240W、料液比1∶30，提取2次，提取時間39min，在此條件下小叢紅景天多糖提取率可達4.305%。本研究結(jié)果為小叢紅景天多糖的研究及小叢紅景天植物的開發(fā)與利用提供了一定的參考。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H.F.by response surface analysis

WANG Li，ZHAO Hua*，MA Ying-li，WANG Xing
（School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

In order to optimize the conditions of ultrasonic-assisted extraction method of polysaccharides from Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H.F.，on the base of single-factor experiment，an equation for the ultrasonic wave extraction was built.The experimence showed that extraction temperature，ultrasonic power，extraction time and liquid-solid ratio had different effects on the extraction yield of polysaccharides．The result indicated that within tested level ranges，the importance of four process parameters affecting extraction yield of polysaccharides order was ultrasonic treatment temperature，ultrasonic power，solid-liquid ratio and ultrasonic treatment time.The optimum conditions of the ultrasonic wave extraction of R.dumulosa polysaccharides were as follows：temperature 69℃，extraction ultrasonic power 240W，solid-liquid ratio 1∶30（g/mL）and extraction time 39min，the extraction rate of R.dumulosa polysaccharides could be up to 4.305%，exhibiting a good agreement with the predicted values.

Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H.F.；polysaccharides；ultrasonic extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0315-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.061

2013-09-28 *通訊聯(lián)系人

王莉（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：植物資源開發(fā)利用研究。

陜西省教育廳專項科研計劃項目（12JK0842）；陜西省重點學科專項建設經(jīng)費資助（2013）。