孫雨薇，王珊珊，徐 浩，余 勇，吳明輝，丁之恩（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

不同方法對(duì)人參皂苷Re提取效果的影響

孫雨薇，王珊珊，徐 浩，余 勇，吳明輝，丁之恩*
（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

采用六種常規(guī)方法提取西洋參葉中皂苷，并結(jié)合HPLC-UV檢測(cè)六種提取方法下所得人參皂苷Re的含量，考察不同提取方法下人參皂苷Re含量的差異，確定最佳西洋參葉中皂苷提取方法。結(jié)果表明：乙醚脫脂-甲醇超聲提取西洋參葉總皂苷及人參皂苷Re含量最高，在乙腈-水梯度洗脫條件下，人參皂苷Re保留時(shí)間在15.2min，色譜峰分離效果好。

西洋參葉，人參皂苷Re，提取，HPLC-UV

西洋參（Panax quinquefolium L.）系五加科人參屬多年生草本植物。我國(guó)自20世紀(jì)80年代大面積成功引種西洋參以來(lái)，已發(fā)展成為繼美國(guó)、加拿大后世界第三大西洋參生產(chǎn)國(guó)和世界第一大消費(fèi)國(guó)。西洋參味苦，性涼，入心、肺、腎經(jīng)，功能以補(bǔ)益為主，可滋陰降火、益氣生津[1]。藥理研究表明，西洋參生藥活性成分為皂苷類成分[2]，為主要次生代謝產(chǎn)物，按其皂苷元的不同分為：達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷、齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷、奧克梯隆型皂苷及其他類型皂苷，目前為止，從西洋參中已發(fā)現(xiàn)60多種人參皂苷[3]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)西洋參根中人參皂苷含量及生理活性的研究很多[4-10]，但對(duì)西洋參葉中皂苷含量及提取方法的研究甚少。本文采用六種不同的常規(guī)提取方法提取西洋參葉中的皂苷成分，并利用HPLC-UV法測(cè)定六種提取方法下單體皂苷Re的含量，系統(tǒng)考察不同提取方法提取西洋參葉皂苷效果的差異，從而確定最佳西洋參葉中皂苷的提取方法，為西洋參葉的深入開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參葉 來(lái)自安徽金寨縣竺山參業(yè)有限公司生產(chǎn)基地4年生植株新鮮葉片，2013年4月下旬采摘，原料帶回實(shí)驗(yàn)室，在80℃條件下烘干、粉碎（過(guò)40目篩）保存，備用；乙腈 色譜純；水 實(shí)驗(yàn)室制備三級(jí)蒸餾水；甲醇 分析純；人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)：HM0523XA1） 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，于4℃冷藏保存。

Waters液相色譜系統(tǒng)（包括1525 Binary HPLC Pump、Waters 2707 Autosampler、Waters Temperature Control ModuleⅡ、Waters 2489 UV/Visible Detecto）美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西洋參葉總皂苷的提取分離

1.2.1.1 甲醇超聲提取-大孔樹(shù)脂柱分離純化法 取干樣品約0.5g，精密稱定，加入適量甲醇后超聲提取1h，提取液蒸干，加水溶解，上AB-8大孔樹(shù)脂柱，依次用水和80%甲醇洗脫，收集80%甲醇相蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5mL容量瓶，即得供試樣品（樣品1）。

1.2.1.2 乙醚脫脂-甲醇超聲提取法 取干樣品約0.5g，精密稱定，置于索氏提取器中，用乙醚脫脂1h，殘?jiān)鼡]盡乙醚，置具塞錐形瓶中，加入20mL甲醇，超聲提取1h，放冷，過(guò)濾，濾液定容到25mL容量瓶，即得供試樣品（樣品2）。

1.2.1.3 甲醇超聲提取法 取干樣品約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入20mL甲醇，超聲提取1h，放冷，過(guò)濾，濾液定容到25mL容量瓶，即得供試樣品（樣品3）。

1.2.1.4 水浸提法 取干樣品約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入20mL純水，50℃水浴提取1h，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ莸?5mL容量瓶，即得供試樣品（樣品4）。

1.2.1.5 甲醇浸提法 取干樣品約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入20mL甲醇，50℃水浴提取1h，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5mL容量瓶，即得供試樣品（樣品5）。

1.2.1.6 微波輔助提取法 取干樣品約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入20mL純水，在微波爐中微波提取3次（每次加熱至沸騰3次），放冷，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5mL容量瓶，即得供試樣品（樣品6）。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Re對(duì)照品20mg，精密稱定，加入甲醇，溶解，制成2.0mg/mL的溶液，即得人參皂苷Re對(duì)照品溶液。

1.2.3 香草醛-硫酸比色法測(cè)定總皂苷的含量

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取人參皂苷Re對(duì)照品10、30、50、60、80、100、120、140、160μL至10mL容量瓶，水浴蒸干甲醇后分別加入8%香草醛乙醇溶液（配制1周內(nèi)可以使用[11]）0.5mL，72%硫酸溶液5.0mL，充分振搖混勻后置60℃恒溫水浴上加熱10min，立即用冰水冷卻10min，搖勻。以試劑作空白，于544nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.2387×C-0.0719，R2=0.9995。

1.2.3.2 樣品中總皂苷含量的檢測(cè)[12]精密吸取1.2.1中各樣品溶液50μL，各3份，分別置于具塞試管中，按1.2.3.1中方法顯色測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算總皂苷的含量，并計(jì)算平均含量。

1.2.4 HPLC法測(cè)定人參皂苷Re 色譜條件：色譜柱為C18柱（250mm×4.60mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），采用梯度洗脫方式，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫35℃，流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，進(jìn)樣量10μL。在表1梯度洗脫條件下，Re保留時(shí)間在15.2min左右，且分離效果好，能夠滿足人參皂苷Re的檢測(cè)分析要求。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 香草醛-硫酸比色法檢測(cè)西洋參葉總皂苷含量

由表2可以看出，樣品2總皂苷含量最高，即乙醚脫脂-甲醇超聲提取法提取西洋參葉總皂苷含量最高。西洋參葉中總皂苷含量在10%左右。六種不同提取方法結(jié)果顯示，葉中脂類對(duì)皂苷的提取有阻礙作用，乙醚脫脂處理能夠破壞植物蠟質(zhì)層、各類樹(shù)脂、葉綠素、胡蘿卜素等脂溶性色素，從而有利于提取溶劑的滲透和皂苷類物質(zhì)的溶出。未經(jīng)脫脂處理的西洋參皂苷粗提物在經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化時(shí)容易堵塞樹(shù)脂孔道從而降低樹(shù)脂對(duì)皂苷的吸附。但對(duì)于西洋參而言，脂類含量較低，提取之前經(jīng)乙醚脫脂處理通常用量過(guò)大或者耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，而對(duì)初提物進(jìn)行乙醚脫脂處理則能夠改善，使操作簡(jiǎn)單，有利于皂苷類成分的純化。

表2 不同提取方法對(duì)西洋參葉總皂苷提取得率的影響Table 2 Effect of different extraction methods on total saponin content of Panax quinquefolium L.leaf

2.2 HPLC法線性關(guān)系考察

精密吸取1.2.2對(duì)照品溶液100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μL至1mL容量瓶，甲醇定容，按1.2.4項(xiàng)色譜條件分析，以人參皂苷Re的濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制Re標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，并進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷Re的回歸方程：Y=3×106X-51802，R2=0.9991，在0.4～2.0mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 Re皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of Re saponins

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按1.2.4項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得人參皂苷Re峰面積的RSD=0.087%，保留時(shí)間RSD=0.044%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖2 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of precision

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of stability test

精密吸取同一供試品（樣品2）溶液20μL，按1.2.4項(xiàng)色譜條件，在0～15h內(nèi)每隔2.5h進(jìn)樣一次，測(cè)得人參皂苷Re峰面積的RSD=0.129%，保留時(shí)間的RSD= 0.162%。結(jié)果表明，供試品在15h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

按照1.2.1項(xiàng)，重新制備皂苷提取樣品1～6，先定容25mL，取15mL定容到5mL，即濃縮原樣品，按照1.2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得人參皂苷Re峰面積及含量如表5所示。

表5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of reproducible test

與表7結(jié)果比較，可以看出這六種方法的重現(xiàn)性較穩(wěn)定，乙醚脫脂-甲醇超聲提取法的提取效果最好。

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的2.5中樣品各0.6mL，精密移取。每份樣品中添加0.6mL對(duì)照品，將供試品溶液與對(duì)照品溶液以1∶1的體積混合，按1.2.4項(xiàng)色譜條件分析，測(cè)得人參皂苷Re的平均回收率為：98.330%，RSD=0.935%。結(jié)果顯示，Re加標(biāo)回收效果好。詳見(jiàn)表6。

2.7 HPLC法測(cè)定樣品Re含量結(jié)果

取1.2.1六種供試品溶液分別進(jìn)行Re含量測(cè)定（色譜條件同1.2.4），色譜圖見(jiàn)圖2，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果顯示，Re色譜峰保留時(shí)間為15.2min左右，樣品2中Re含量最高，其次是樣品1。即，乙醚脫脂-甲醇超聲提取法提取西洋參葉Re皂苷含量最高。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of recovery test

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)用6種不同的提取方法對(duì)西洋參葉中人參皂苷Re進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明用乙醚脫脂-甲醇超聲提取法為最佳制備方法，此法提取率高、重現(xiàn)性好、加標(biāo)回收率穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)單。大孔樹(shù)脂柱法（AB-8樹(shù)脂）對(duì)單體皂苷Re的提取率也比較高，但操作復(fù)雜，需對(duì)粗提物進(jìn)行脫脂處理，以防樹(shù)脂堵塞。其他4種方法都有較大的損失，且雜質(zhì)太多，不利于含量測(cè)定，不能反應(yīng)西洋參葉中皂苷的實(shí)際含量，故而我們選擇乙醚脫脂-甲醇超聲提取法提取西洋參葉中皂苷。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，供試品為從西洋參葉中直接提取所得，背景干擾較大，色譜峰很難分離。本文通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相濃度和洗脫時(shí)間梯度，優(yōu)選滿足本實(shí)驗(yàn)分析要求的色譜條件，梯度洗脫，分離效果良好。

由于用藥習(xí)慣等因素的影響，許多藥用植物的其他部位都沒(méi)有被利用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示西洋參葉中皂苷含量較高，是提取人參皂苷的一個(gè)重要資源，采用乙醚脫脂-甲醇超聲提取法能夠有效提取西洋參葉皂苷，有利于西洋參的綜合利用，對(duì)充分開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)藥用植物資源有重要意義。

表7 樣品測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of sample determination

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Effect of different kinds of conventional extraction methods on the contents of ginsenoside Re from Panax quinquefolium L.leaf

SUN Yu-wei，WANG Shan-shan，XU Hao，YU Yong，WU Ming-hui，DING Zhi-en*
（College of Tea and Food Technology，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China）

In this experiment，six conventional methods were used to extract panax quinquefolium saponin from leaves，and HPLC-UV method was used to detect the content of six kinds of method for extracting monomer ginsenoside Re，to investigate the content of different extraction methods monomer ginsenoside Re，finally，to determine the bestextraction method.The results showed that：in the premise of ether degreasing，we used methanol ultrasonic to extract panax quinquefolium saponin from leaves，then got the highest content of the total saponins and ginsenoside Re.Results under the gradient elution condition between water and acetonitrile，the retention time of Re was 15.2min，and the chromatographic peak was clear and distinguished.

Panax quinquefolium L.leaf；ginsenoside Re；conventional extraction；HPLC-UV

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0301-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.058

2013－09－26 *通訊聯(lián)系人

孫雨薇（1987-），女，碩士研究生，主要從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)方面的研究。

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（30271100）。