史文婷，劉　寅，趙　越，毛多斌，楊雪鵬（鄭州輕工業(yè)學院，食品與生物工程學院，河南鄭州450000）

米曲霉產果糖基轉移酶發(fā)酵條件優(yōu)化與分離純化

史文婷，劉寅，趙越，毛多斌，楊雪鵬*
（鄭州輕工業(yè)學院，食品與生物工程學院，河南鄭州450000）

通過單因素實驗和均勻設計實驗對一株產果糖基轉移酶的米曲霉搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，其最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度24℃，轉速161r/min，裝液量50mL/250mL，起始pH5.0，接種量1%，發(fā)酵時間96h。在該條件下，果糖基轉移酶酶活力達到33.07U/mL，較優(yōu)化前提高64.6%。通過Desalting脫鹽柱，DEAE FF陰離子柱和SepHacryl S-100 HR凝膠柱等分離純化步驟，經SDS-PAGE檢測，該酶呈現(xiàn)一條帶，純化倍數(shù)、酶的比活力和收率分別為29.35、231.14U/mg和48.9%。經薄層層析檢測，該酶能夠生成蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a），證明該酶為果糖基轉移酶。經計算，該酶分子量約為92.8ku。

米曲霉，果糖基轉移酶，優(yōu)化，分離純化

圖1　受體反應示意圖Fig.1　The graph of acceptor reaction

隨著人們生活水平的提高，果聚糖（FOS）這類保健糖的需求量不斷增大。工業(yè)上，通常采用酶法生產FOS，其原理為果糖基轉移酶催化裂解蔗糖形成葡萄糖和酶與果糖的過渡態(tài)復合物，復合物受到親核化合物攻擊時果糖基轉移到不同的受體上生成不同的果糖苷或果糖，這種反應稱為受體反應（Acceptor reaction），如圖1所示，其中，INV（Invertase）表示轉化酶，1-SST（Fructosyltransferase）表示果糖基轉移酶，G表示葡萄糖，F(xiàn)表示果糖[1]。近期有關低聚果糖功能的研究較多，例如胡曉燕、郝選明研究發(fā)現(xiàn)，補充低聚果糖可以改善甚至逆轉6周遞增負荷訓練引起的大鼠一系列機能下降現(xiàn)象，表明其對免疫抑制有顯著調節(jié)作用[2]；王乃強、李國慶等研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖能夠顯著提高小鼠對鈣離子的吸收效率，為低聚果糖在補鈣食品行業(yè)中的應用提供理論支持[3]；劉曉梅、彭芝榕等研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖和乳酸桿菌均具有潤腸通便的作用并對維持腸道菌群平衡、抑制腸球菌和腸桿菌的生長有較好功效，其通便功用大小與藥物劑量濃度有關[4]。

本課題組前期篩選得到了米曲霉菌株，該菌株所產果糖基轉移酶轉移能力較強[5-7]，并能夠合成蔗糖-6-乙酸酯[8]，故通過采用薄層層析（TLC）技術檢測蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a）的生成來鑒定所得到的酶為果糖基轉移酶。

本實驗通過對米曲霉菌株進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并對發(fā)酵后酶液進行分離純化，以期得到純度較高的酶，為后期進行果糖基轉移酶受體反應的動力學和熱力學的微觀研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

米曲霉O-1由實驗室保藏；蔗糖、葡萄糖、果糖、蔗果三糖、蔗果四糖、低聚果糖、葡萄糖-6-乙酸酯（g-6-a）、蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a）標樣均購于Sigma公司；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為國產分析純；馬鈴薯培養(yǎng)基蔗糖16g，馬鈴薯200g，磷酸氫二鉀0.2%，dH2O 1L。

Waters 1525 Binary型高效液相色譜儀美國Waters；AKTA explorer 10S型蛋白質純化儀GE公司；DYCZ-24DN型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1粗酶液的制備取一支活化后的斜面，加入無菌水，制備成孢子懸液，取300μL孢子懸液加入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，160r/min培養(yǎng)。用6層紗布將菌體過濾洗滌擰干后懸浮于最適緩沖液（pH6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液），進行超聲波破碎。破碎后經10000r/min，離心60min，上清液即為粗酶液。

1.2.2酶活力測定取2mL 10%的蔗糖溶液（最適緩沖液配制），加入40μL酶液（以蔗果三糖的量不超過總糖的10%為宜）。50℃水浴振蕩反應30min，沸水浴15min終止酶反應，離心取上清液制備樣品。酶活力定義：50℃條件下，每分鐘催化蔗糖生成1μmol蔗果三糖所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

酶活力=0.2×GF2%×1000/（0.504×t×V）[9]

式中：0.2—蔗糖總量（g）；GF2%—蔗果三糖的百分含量；0.504—1μmol蔗果三糖的含量（mg）；t—反應時間（min）；V—上清酶液體積（mL）。

1.2.3糖的檢測檢測器：Waters 2424 ELS Detector；色譜柱：大連依利特NH2柱（250×4.6mm）；流動相為乙腈-水（75∶25）；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃，分析時間30min。

1.2.4米曲霉產果糖基轉移酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.4.1單因素實驗單因素實驗包括：起始pH、裝液量、接種量、溫度、轉速以及發(fā)酵時間，所有實驗均設置3個平行。

1.2.4.2均勻設計利用單因素方差分析法分析上述實驗結果，選取影響產酶顯著的四個因素進行均勻設計。選取的四個因素為裝液量、轉速、接種量和溫度，每個因素設置5個水平，采用均勻設計表U5（54），見表1。其他培養(yǎng)條件：起始pH5.0，發(fā)酵時間96h。

1.2.5蛋白質含量的測定參照文獻[10]。

表1　U5（54）均勻設計表Table 1　U5（54）uniform design table

1.2.6SDS電泳檢驗參照文獻[11]。

1.2.7酶的分離純化將發(fā)酵后的粗酶液30K中空纖維柱濃縮后，冷凍干燥成粉末，向粉末中加入適量的最適緩沖液，混勻后，依次通過Desalting脫鹽柱、DEAE FF陰離子柱和SepHacryl S-100 HR凝膠柱，流速為1.0mL/min，凝膠柱上樣量為10mL，其他兩個柱子上樣量均為1mL。脫鹽柱與凝膠柱均用最適緩沖液進行洗脫，陰離子柱依次用pH6.0、5.0、4.0、3.0的磷酸-檸檬酸緩沖液進行洗脫，最后用pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液（含1mol/L NaCl）洗脫?；厥崭鱾€純化步驟的吸收峰進行酶活測定。

1.2.8薄層層析硅膠板為TLC Silica gel 60；層析液為正丁醇∶無水乙醇∶蒸餾水=5∶3∶2，展開兩次，顯示劑：5%硫酸甲醇。

2　結果與分析

2.1米曲霉果糖基轉移酶的產酶條件優(yōu)化

2.1.1單因素實驗優(yōu)化產酶條件

2.1.1.1裝液量對產酶的影響裝液量反映了菌株對溶氧的要求，在好氧培養(yǎng)中，氧氣的供應往往是發(fā)酵過程能否成功的重要因素之一，氧氣不足時容易引起乙酸的積累從而影響菌體的生長和產酶量[12]。從圖2中可知，裝液量為20mL/250mL時酶活最高，其次為40mL/250mL，這可能因為該米曲霉在氧氣充足的環(huán)境更有利于生長和產酶。由于兩者酶活相差不多，考慮到培養(yǎng)基的利用效率，故裝液量采用40mL/250mL。

圖2　裝液量對產酶的影響Fig.2　Effect of loaded liquid on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.2接種量對產酶的影響接種量決定著菌體的密集程度，適當?shù)拿芗燃扔欣诰w的生成，也有利于產酶，若密集程度過高，反而會因為營養(yǎng)消耗太快或通氧量不足等問題使酶產量降低[13]。從圖3可知，隨著接種量的增加，酶活力的總體趨勢呈現(xiàn)先減小再增加再減少的過程，這也與上述的理論相符合。當接種量為300μL/40mL時，由于此時的養(yǎng)分和溶氧最有利于菌體的生長于產酶，故果糖基轉移酶的酶活力最大。

圖3　接種量對產酶的影響Fig.3　Effect of inoculum size on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.3發(fā)酵時間對產酶的影響測定不同發(fā)酵時間培養(yǎng)的發(fā)酵液的酶活力，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，果糖基轉移酶酶活也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，當發(fā)酵時間達到96h時，酶活達到最大，之后酶活力開始降低，這可能由于發(fā)酵前期，米曲霉主要進行自身繁殖生長，同時伴隨有果糖基轉移酶的生成，當發(fā)酵到96h，此時米曲霉達到最大生物量，故產酶量最高，隨著發(fā)酵繼續(xù)進行，米曲霉開始進入衰亡期，故產酶量下降。因此，選擇96h作為最佳培養(yǎng)時間。

圖4　發(fā)酵時間對產酶的影響Fig.4　Effect of fermentation time on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.4起始pH對產酶的影響pH主要從酶的活性，細胞膜所帶電荷的狀態(tài)以及代謝過程等方面影響菌體生長繁殖和發(fā)酵產物合成，因此，采用不同起始pH的發(fā)酵培養(yǎng)基對米曲霉產酶進行研究[14]，結果見圖5。由圖5可知，當起始pH為5.0時酶活力最高，這表明該米曲霉在偏酸性的環(huán)境中能夠更好生長與產酶。

2.1.1.5溫度對產酶的影響溫度主要從發(fā)酵動力學特性，菌體代謝產物合成方向，微生物代謝調節(jié)機制，發(fā)酵液的理化性質等方面來影響產物的合成[15]。當溫度升高時，米曲霉的代謝加快，這就加速酶的產生，但是當溫度超出了米曲霉的最適溫度時，由于米曲霉的代謝受到一定程度的限制，從而使產酶量下降。通過對溫度因素的考察，結果如圖6所示。從圖6中可知，當溫度為28℃時，果糖基轉移酶的酶活力最高，這說明，當溫度達到28℃時，米曲霉生長代謝最為旺盛，產酶量最多，故酶活最高。

圖5　起始pH對產酶的影響Fig.5　Effect of initial pH on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

圖6　溫度對產酶的影響Fig.6　Effect of temperature on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.6轉速對產酶的影響轉速與裝液量均為影響溶氧的重要因素，因此對轉速的研究也十分重要。從圖7中可知，當搖床轉速為150r/min時，米曲霉所產果糖基轉移酶的酶活達到最大，這說明該轉速下，發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量更加有利于米曲霉菌體的生長，故酶活最高。

圖7　轉速對米曲霉產果糖基轉移酶的影響Fig.7　Effect of rotate speed on fructosyltransferase production produced by Aspergillus oryzae

2.1.2均勻設計實驗經過均勻設計實驗，結果見表2。

表2　均勻實驗結果Table 2　The result of uniform design

通過DPS軟件進行回歸分析，得到酶活大小（Y）與各因素（X）之間的關系方程為Y=63.567+0.006X3-1.394X4+0.0000076X32，相關系數(shù)R=0.999，F(xiàn)=5282.71，p=0.0101。各因素的最佳組合為：裝液量50mL/250mL，轉速161r/min，接種量500μL（1%），溫度24℃，理論酶活可達35.14U/mL。根據(jù)DPS軟件回歸分析的結果進行驗證實驗，發(fā)酵液酶活為33.07U/mL，與理論值相符。通過優(yōu)化，酶活力較優(yōu)化前提高了64.6%，這說明該優(yōu)化是行之有效的，這為后面進行酶的分離純化奠定了良好的基礎。

2.2酶的分離純化

分離純化步驟結果見表3。

從表3中可以看出，經過分離純化，酶的比活力達到231.14U/mg，純化倍數(shù)達到29.35，收率為48.9%。經SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖8所示。從圖8中可知，所純化的樣品呈現(xiàn)一條帶。經計算[11]，該米曲霉果糖基轉移酶的相對分子質量大致為92.8ku。

圖8　SDS-PAGE電泳圖Fig.8　SDS-PAGE pattern of the purified protease from Aspergillus oryzae

對分離純化后得到的純酶液進行薄層層析（TLC），檢測其能否催化蔗糖生成s-6-a，結果見圖9。如圖9所示，經過一系列純化步驟后，得到的電泳純的酶液能夠催化葡萄糖-6-乙酸酯（g-6-a）生成蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a），故證明了該純化后的酶液為果糖基轉移酶。

圖9　純酶的蔗糖-6-乙酸酯檢測Fig.9　The detection of s-6-a for fructosyltransferase after purification

3　結論

經過單因素實驗和均勻設計實驗，對一株米曲霉產果糖基轉移酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到了最優(yōu)的產酶條件：裝液量50mL/250mL，接種量1%，溫度24℃，轉速161r/min，起始pH5.0，培養(yǎng)時間96h。通過優(yōu)化，果糖基轉移酶的酶活力可高達33.07U/mL，較之前提高了64.6%。將優(yōu)化后粗酶液進行超濾、凝膠柱層析等純化過程，得到了電泳純的酶液，純化倍數(shù)、比活力和收率分別為29.35、231.14U/mg和48.9%。經薄層層析檢測，該純化后的酶液能夠生成蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a），故證明純化后的酶液為果糖基轉移酶。經計算，該酶的分子量為92.8ku，與相關文獻結果較為接近[16-18]。

為了對該酶進行動力學、熱力學反應研究以及酶的應用研究，擬對純化后的酶進行進一步的氮端測序，以期采用基因工程的方法獲得大量的純酶。

表3　果糖基轉移酶各純化步驟結果Table 3　Separation and purification of fructosyltransferase

[1]Altenbach D，Rudino-Pinera E，Olvera C，et al.An acceptorsubstrate binding site determining glycosyl transfer emerges from mutant analysis of a plant vacuolar invertase and a fructosyltransferase[J].Plant Mol Biol，2009，69：47-56.

[2]胡曉燕，郝選明．補充低聚果糖對遞增負荷訓練大鼠免疫指標的影響[J]．中國運動醫(yī)學雜志，2012（4）：336-340．

[3]王乃強，李國慶，劉輝，等．低聚果糖促進鈣離子吸收的研究[J]．精細與專用化學品，2013（5）：20-23．

[4]劉曉梅，彭芝榕，倪學勤，等．低聚果糖、乳酸桿菌對便秘模型大鼠的通便功能影響[J]．食品科學，2013（11）：296-299．

[5]Chen LP，Han YW，Mao DB.Activity identification and analysis of fructosyltransferase from different strains[J].Xiandai Nongye Keji，2009，18：332-335.

[6]Chen LP，Han YW，Mao DB.Cloning and analysis of fructosyltransferase gene from Bacillus subtilis[J].Journal of Henan Agricultural University，2009，47：21-26.

[7]Han YW，Chen LP，Mao DB.Expression and activity analysis of sucrose：sucrose 1-fructosyltransferase from onion，New Biotechnology，2010，27：341-346.

[8]Han YW，Liu GM，Huang DY，et al.Study on the synthesis of sucrose-6-acetate catalyzed by fructosyltransferase from Aspergillus oryzae[J].New Biotechnology，2011，28：14-18.

[9]何熙璞，張敏，蔣勇才，等．產果糖基轉移酶米曲霉菌株的選育[J]．食品研究與開發(fā)，2007，28（9）：1-4．

[10]蘇雪燕，車程川，劉金峰，等．地衣芽胞桿菌產纖溶酶的分離、純化及其酶學性質研究[J]．曲阜師范大學學報，2013（7）：85-88．

[11]聶立影，鄭春陽．來自Pyrococcus horikoshii的極端耐熱β-1，4-內切纖維素酶的分離純化與酶學性質[J]．天津理工大學學報，2013（8）：51-56．

[12]Goyal D，Sahni G，Sahoo D K.Enhanced production of recombinant streptokinase in Escherichia coli using fed-batch culture[J].Bioresource Technology，2009，100（19）：4468-4474.

[13]竇燁，王清路，李俏俏．畢赤酵母工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]．食品工業(yè)科技，2008（6）：168-171．

[14]Wu Q，Xu H，Ying HJ，et al.Kinetic analysis and pH-shift control strategy for poly（gamma-glutamic acid）production with BacillussubtilisCGMCC0833[J].BiochemicalEngineering Journal，2010，50（2）：24-28.

[15]Wei G，Li Y，Du G.Application of a two-stage temperature control strategy for enhanced glutathione production in the batch fermentation by Candida utilis[J].Biotechnol Lett，2003，25：887-890.

[16]楊正茂，秦克亮，趙玉秀，等．β-果糖基轉移酶和β-呋喃果糖苷酶的分離純化[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33（5）：219-222．

[17]Lamia L’Hocine，Zhang W Bo，et al.Purification and partial characterizationoffructosyltransferaseandinvertasefrom Aspergillus niger AS0023[J].Biotechnology，2000，81（1）：73-84.

[18]陳華．海藻糖合成酶和果糖基轉移酶的分離純化及部分性質研究[D]．南寧：廣西大學，2001．

Fermentation conditions optimization and purification of fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

SHI Wen-ting，LIU Yin，ZHAO Yue，MAO Duo-bin，YANG Xue-peng*
（Food and Bioengineering College，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450000，China）

The optimal fermentation conditions of fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae was studied by single-factor experiment and uniform design.The optimized conditions was temperature 24℃，rotation rate 161r/min，medium volume 50mL/250mL，initial pH5.0 and inoculum size 1%.The highest enzyme activity was 33.07U/mL after 96h，64.6%higher than before.The fructosyltransferase was separated and purified by using a procedure including column chromatography separation by Desalting，DEAE FF and SepHacryl S-100 HR.The final purified fold，specific activity and yield of the purified enzyme were 29.35，231.14U/mg and 48.9%，respectively.The purified enzyme was confirmed to be homogeneous by SDS-PAGE.Detected by thin layer chromatography（TLC），the enzyme was able to generate sucrose-6-acetate（s-6-a），as proof of fructosyltransferase.Its molecular weight was estimated to be 92.8ku.

Aspergillus oryzae；fructosyltransferase；optimization；purification

TS201.3

A

1002-0306（2014）14-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.038

2013－09－27*通訊聯(lián)系人

史文婷（1989-），女，碩士研究生，主要從事酶工程方面的研究。

國家自然科學基金項目（20676127）；河南省農業(yè)科技攻關項目（102102110044）。