王玉霞，張　超（．宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程研究所，四川宜賓644000；2．宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程研究所，四川宜賓644000）

主要釀造因子對(duì)野生酵母β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響

王玉霞1，張超2，*
（1．宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程研究所，四川宜賓644000；2．宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程研究所，四川宜賓644000）

實(shí)驗(yàn)考察了典型葡萄酒釀造因子糖、酸、醇對(duì)野生酵母β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響，以評(píng)價(jià)菌株在葡萄酒釀造條件下的應(yīng)用性能。結(jié)果表明，各菌株β-葡萄糖苷酶主要定位在胞內(nèi)，總酶活力以H.uvarum菌株的0.51U/mL為最高，P.fermentans菌株最小。各釀造因子對(duì)菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響差異較大。較高初始糖含量和低pH條件對(duì)各菌株產(chǎn)酶都有顯著地抑制作用，其中P.fermentans菌株受抑制作用最大，在pH3.0條件下受抑制程度達(dá)到了63.50%～84.32%，Saccharomyces和Hanseniaspora兩屬酵母受影響較小，且H.uvarum在酸性條件下的產(chǎn)酶量最高。較低濃度的乙醇（5%）對(duì)菌株產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用，隨著乙醇含量的增加，各菌株產(chǎn)酶量都受到了顯著抑制，P.fermentans菌株甚至沒(méi)有酶的產(chǎn)生。綜合各因子對(duì)各菌株產(chǎn)酶量的影響情況，H.uvarum菌株以較優(yōu)表現(xiàn)展示出其較好的應(yīng)用前景。

野生酵母，β-葡糖苷酶，釀造因子

來(lái)自水果等原料的香氣物質(zhì)，以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種方式存在。游離態(tài)香氣物質(zhì)直接呈現(xiàn)出能被感知的氣味，而含量較多的無(wú)色、無(wú)味、不具揮發(fā)性結(jié)合態(tài)的香氣多數(shù)為糖苷類物質(zhì)，必須經(jīng)過(guò)水解才能使香氣表現(xiàn)出來(lái)[1-3]。糖苷類風(fēng)味物質(zhì)的水解分為酸水解和酶水解兩類。其中作用溫和、反應(yīng)迅速、高效率的酶水解，在生產(chǎn)中倍受青睞[4]。β-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是一類能水解糖鏈非還原末端糖苷鍵的一類水解酶。因廣泛用于果汁、果酒等結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)的水解，釋放香氣成分而被稱為風(fēng)味酶。糖苷類風(fēng)味物質(zhì)的水解涉及多種酶的參與，β-葡萄糖苷酶是其中的關(guān)鍵酶[5-6]。

β-葡萄糖苷酶在自然界的分布非常廣泛，包括植物、動(dòng)物、昆蟲(chóng)、絲狀真菌、酵母菌、細(xì)菌等[1，7]。與植物、動(dòng)物、昆蟲(chóng)以及細(xì)菌相比，酵母細(xì)胞所具有的培養(yǎng)、生長(zhǎng)特性，使從酵母菌中篩選比活高、特性優(yōu)良的β-葡萄糖苷酶成為優(yōu)勢(shì)。尤其是從釀造環(huán)境中篩選能體現(xiàn)區(qū)域酒種風(fēng)格的優(yōu)良酵母，這個(gè)優(yōu)勢(shì)就更為明顯了[8-9]。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察典型葡萄酒釀造因子糖、酸、醇對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響，評(píng)價(jià)酵母菌株在葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛能，為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

所用菌株分離自果園土壤，鑒定為Hanseniaspora uvarum、Saccharomyces cerevisiae和Pichia fermentans菌株；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉 英國(guó)oxoid公司，分析純；葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鈉、咪唑、GSH、曲通、甲苯、乙醇中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純；pNPG（p-nitrophenyl-β-D-glycoside）Sigma-Aldrich，分析純；其余所有試劑均為分析純。

HX-9080B-2型生化恒溫培養(yǎng)箱上海福碼實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PB2002-N型稱量天平、AB204-E型分析天平、320-S型精密pH計(jì)Delta瑞士Mettler Toledo公司；SS325型高壓蒸汽全自動(dòng)滅菌鍋日本Tomy公司；無(wú)菌超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備廠；酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo公司；3K型冷凍高速離心機(jī)德國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定pH5.0 P-C緩沖溶液：稱取Na2HPO43.689g、C6H8O71.01g溶于100mL蒸餾水中，調(diào)pH至5.0并定容。底物（pNPG）工作液：準(zhǔn)確稱取150.65mg pNPG，完全溶解于100mL pH5.0的P-C緩沖中備用。

酶活測(cè)定：將菌株28℃靜置培養(yǎng)3d的發(fā)酵液4℃，8000×g離心5min，取5μL上清液與100μL底物pNPG溶液（5mmol/L）混勻，50℃保溫30min，加入200μL 1mol/L Na2CO3中止反應(yīng)并顯色，將反應(yīng)液在400nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值[10]。

酶活力單位定義：在標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1μmol的pNP所用的酶量為一個(gè)酶活單位[10]。

1.2.2培養(yǎng)基液體YPD（w/v）：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。依據(jù)葡萄醪平均pH（3.5～4.0）、葡萄醪平均糖含量（20%）、普通葡萄酒酒度（12%），分別對(duì)選擇的代表菌株進(jìn)行不同逆境條件下產(chǎn)酶情況的考察。產(chǎn)酶條件分別選培養(yǎng)初始條件為葡萄糖含量20%（200g/L），pH3.0、4.0、5.0以及5%、10%、15%的乙醇濃度。以5%接種量分別接種各類培養(yǎng)基，28℃，200r/min搖瓶培養(yǎng)，三次重復(fù)。每天測(cè)定酶產(chǎn)量，連續(xù)9d，以考察產(chǎn)酶量的最大時(shí)間及各菌株產(chǎn)酶差異情況。對(duì)照為2%葡萄糖的普通YPD培養(yǎng)基，pH自然，不加乙醇。在考察20%葡萄糖初始含糖量對(duì)菌株產(chǎn)酶情況影響實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)測(cè)定酶產(chǎn)量的同時(shí)，監(jiān)控測(cè)定培養(yǎng)基pH變化情況。

1.2.3酶在細(xì)胞的定位YPD培養(yǎng)基50mL/250mL三角瓶，5%接種量，30℃，200r/min，培養(yǎng)48h。

取1mL細(xì)胞培養(yǎng)液8，000×g、4℃條件下離心15min，取上清液并測(cè)定酶活（胞外）；收集細(xì)胞用無(wú)菌水清洗兩次、8，000×g、4℃條件下離心10min后，棄去上清液，向沉淀中加入0.2mL P-C緩沖溶液（pH5.0），漩渦振蕩均勻，按常規(guī)方法測(cè)定酶活（細(xì)胞膜）。

另取5mL細(xì)胞培養(yǎng)液8，000×g、4℃條件下離心15min，收集細(xì)胞用無(wú)菌水清洗兩次、8，000×g、4℃條件下離心10min后，向細(xì)胞沉淀中加入1mL咪唑、50μL GSH、10μL曲通、50μL甲苯∶乙醇（1∶4，v/v），漩渦振蕩5min，8，000×g、4℃條件下離心5min后收集沉淀，加入5mL無(wú)菌冰水搖勻后，取1mL冰水溶液離心并用冰水洗滌數(shù)次，收集沉淀，加入0.2mL P-C緩沖溶液（pH5.0），溶液按常規(guī)方法測(cè)定酶活（細(xì)胞內(nèi)）[11]。所有測(cè)定均重復(fù)三次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行處理分析。

2　結(jié)果與分析

2.1酶在細(xì)胞的定位

在對(duì)各野生菌株產(chǎn)酶情況考察之前，首先分析了不同產(chǎn)酶菌株β-葡萄糖苷酶在細(xì)胞中的定位情況。從圖1中數(shù)據(jù)分析在胞內(nèi)、細(xì)胞膜和細(xì)胞外β-葡萄糖苷酶活力分布情況，可以得出，所有參試種屬菌株的酶都主要定位在細(xì)胞內(nèi)，約占了全部酶活的39.30%～47.35%，其中胞內(nèi)酶活比例占的最大的是P.fermentans酵母，最低的是S.cerevisiae酵母。S.cerevisiae和H.uvarum酵母胞外酶活比例較大，最小的是P.fermentans酵母，只有21.25%的β-葡萄糖苷酶活在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中存在。三個(gè)菌株定位在細(xì)胞膜的β-葡萄糖苷酶差異不是很大，集中在28.45～32.80%這個(gè)小范圍內(nèi)。

圖1　菌株β-葡萄糖苷酶定位情況Fig.1　Enzyme location of different yeast strains

然而從各菌株總酶活情況可以得出（圖2），三個(gè)菌株的總酶活H.uvarum最大，達(dá)到0.51U/mL，其次是S.cerevisiae菌株（0.43U/mL），最低的是P.fermentans 0.22U/mL，只有最高總酶活力H.uvarum菌株的42.55%。

圖2　菌株β-葡萄糖苷酶總酶活Fig.2　Total enzymatic activities from different yeast strains

2.2釀造因子對(duì)酶產(chǎn)量的影響

2.2.1200g/L葡萄糖對(duì)各菌株產(chǎn)酶的影響從表1數(shù)據(jù)可以看出，與對(duì)照培養(yǎng)基相比，菌株在高糖培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)過(guò)程中pH都比較低。這是由于高碳氮比培養(yǎng)條件下，微生物代謝過(guò)程菌體產(chǎn)酸能力提高，以及菌體在高糖環(huán)境下，自身對(duì)這種脅迫效應(yīng)的一種保護(hù)機(jī)制。

表1　高糖條件下各菌株發(fā)酵過(guò)程中pH變化情況Table 1　pH change of different strains with high glucose fermentation

表2　高糖條件下各菌株產(chǎn)酶情況比較Table 2　Comparison the enzyme production of different strains under high glucose concentration

表2數(shù)據(jù)展示了各菌株在高糖和對(duì)照培養(yǎng)基中產(chǎn)酶變化情況。三個(gè)菌株在高糖條件下的產(chǎn)酶量分別為P.fermentans菌株0.045～0.140U/mL，H.uvarum菌株0.206～1.750U/mL，S.cerevisiae菌株0.100～1.110U/mL，而對(duì)照培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶量分別為P.fermentans菌株0.137～0.741U/mL，H.uvarum菌株0.415～2.520U/mL，S.cerevisiae菌株0.346～2.443U/mL。與對(duì)照相比，高濃度葡萄糖含量對(duì)各菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力都表示出了顯著的抑制作用。其中受高葡萄糖影響最強(qiáng)的是P.fermentans菌株，與對(duì)照培養(yǎng)基相比，高糖條件下產(chǎn)酶量減少了67.15%～81.54%，其次是S.cerevisiae菌株的48.28%～71.10%。H.uvarum在三個(gè)菌株中表現(xiàn)最優(yōu)，在對(duì)照和高糖條件下產(chǎn)酶量都顯著高于其他菌株，在兩種培養(yǎng)條件下的最大產(chǎn)酶量分別為1.75U/mL和2.52U/mL。在測(cè)試期間內(nèi)，高糖初始條件對(duì)H.uvarum菌株產(chǎn)酶的抑制作用，除第1d外（50.36%），基本在50%范圍以下，遠(yuǎn)低于P.fermentans和S.cerevisiae菌株。由此可見(jiàn)，在相同培養(yǎng)條件下，H.uvarum菌株顯著高于其他菌株，表現(xiàn)出了較強(qiáng)于其他菌株的應(yīng)用性能。

2.2.2低pH對(duì)各菌株產(chǎn)酶的影響由表3可知，分屬于三個(gè)種的參試菌株的產(chǎn)酶情況，都顯著受到低pH的強(qiáng)烈抑制，其中pH3.0對(duì)各菌株的產(chǎn)酶量影響最大。與對(duì)照相比，在pH3.0條件下，P.fermentans受到的抑制作用達(dá)到了63.50%～84.32%，其次是S.cerevisiae菌株的59.76%～82.08%。受抑制程度最小的是H.uvarum菌株，產(chǎn)酶量達(dá)到了0.078～0.871U/mL（pH3.0條件下），0.320～1.613U/mL（pH4.0條件下），0.331～1.964U/mL（pH5.0條件下）。隨著pH升高，各菌株產(chǎn)酶量顯著增加。在相同pH條件下，三個(gè)菌株的產(chǎn)酶量差異較大，其中H.uvarum菌株比P.fermentans和S.cerevisiae菌株的產(chǎn)酶量要高，且達(dá)到了顯著差異水平，三個(gè)菌株產(chǎn)酶量從高到低的順序是H.uvarum菌株、S.cerevisiae菌株、P.fermentans菌株。與其他菌株相比，H.uvarum菌株在低pH條件下較好地產(chǎn)酶特性，顯示出此菌較好地在低pH條件下的應(yīng)用潛能。

表3　不同初始pH條件下各菌株產(chǎn)酶情況Table 3　Production of enzyme with different start pH values

2.2.3乙醇對(duì)各菌株產(chǎn)酶的影響從不同濃度乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4）可以得出，低濃度乙醇對(duì)各菌株的產(chǎn)酶都有一定程度的促進(jìn)作用。含有初始濃度5%乙醇的培養(yǎng)條件下，三個(gè)菌株的產(chǎn)酶量，在前期基本都有顯著地增加，其中P.fermentans菌株在第5d的增幅最大，達(dá)到了61.75%，其次是S.cerevisiae菌株第3d的增加量54.10%。隨著培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加各菌株產(chǎn)酶量都受到了強(qiáng)烈的抑制，其中最強(qiáng)的是P.fermentans菌株，在10%和15%乙醇濃度下，甚至沒(méi)有β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生，而H.uvarum和S.cerevisiae菌株產(chǎn)酶量都顯著低于對(duì)照，且10%乙醇濃度對(duì)酶產(chǎn)生的抑制程度達(dá)到了90%以上。從酶學(xué)性質(zhì)角度分析，高濃度醇對(duì)酶蛋白有一定的變性作用，從而導(dǎo)致酶活力的損失。本實(shí)驗(yàn)中高濃度乙醇對(duì)酶產(chǎn)量的影響，是酶受乙醇的變性失活作用和酵母細(xì)胞產(chǎn)酶受抑制兩方面的綜合影響效果。在一定濃度乙醇存在條件下，H.uvarum菌株產(chǎn)酶量表現(xiàn)顯著高于S.cerevisiae菌株的特性，這將在一定程度上賦予其釀造條件下較好的應(yīng)用前景。

表4　不同醇濃度對(duì)各菌株產(chǎn)酶情況的影響Table 4　Production of enzyme from different strains with different ethanol concentrations

3　討論

綜合糖、pH、醇三因子對(duì)各菌株產(chǎn)酶情況考察結(jié)果，可以得出各釀造因子對(duì)菌株的影響程度各不相同。pH實(shí)驗(yàn)中，隨著pH的降低，所有菌株的產(chǎn)酶量都受到強(qiáng)烈的抑制。醇實(shí)驗(yàn)中，在5%醇濃度下，一定時(shí)期內(nèi)，參試菌株的產(chǎn)酶量都高于對(duì)照。乙醇雖然是一種脅迫因子，但在一定濃度范圍內(nèi)，也是一種有效提高細(xì)胞通透性的試劑，低濃度條件下因?yàn)閷?duì)細(xì)胞的傷害作用較小，相反在一定程度上卻提高了細(xì)胞膜的通透性，使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲到胞外的量較正常情況有所增加，而表現(xiàn)出胞外發(fā)酵上清液中酶量的增加。但隨著濃度的升高，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝的較強(qiáng)的抑制作用，以致P.fermentans菌株在高濃度乙醇存在條件下，已經(jīng)檢測(cè)不到酶的產(chǎn)生[12]。

4　結(jié)論

β-葡萄糖苷酶在細(xì)胞中的定位情況顯示，三個(gè)菌株的β-葡萄糖苷酶都主要定位在胞內(nèi)?？偯富钭畲蟮氖荋.uvarum菌株，達(dá)到了0.51U/mL，其次是S.cerevisiae菌株。高糖和低pH對(duì)各菌株產(chǎn)酶能力影響各不相同。H.uvarum菌株無(wú)論是在高糖還是對(duì)照條件下，分別以1.750U/mL和2.520U/mL的產(chǎn)酶量顯著高于其他菌株，且在最低pH3.0的條件下產(chǎn)酶量也顯著高于其他菌株，充分顯示出較強(qiáng)的應(yīng)用潛能。在發(fā)酵前期，較低濃度乙醇（5%）對(duì)所有菌株的產(chǎn)酶量都有一定的促進(jìn)作用，然而隨著乙醇濃度的升高，各菌株產(chǎn)酶量迅速下降，甚至沒(méi)有β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生（P.fermentans）。H.uvarum在對(duì)照、高糖以及低pH條件下，產(chǎn)酶量顯著高于其他菌株的較好表現(xiàn)，急需在進(jìn)一步研究中進(jìn)行考察，從而挖掘其釀造應(yīng)用潛能。由于釀造因子單因子條件下，菌株產(chǎn)酶情況差異較大，因此需要在后期研究中進(jìn)一步考察菌株在實(shí)際釀造條件下的產(chǎn)酶情況，以全面探索菌株的釀造特性，以及對(duì)釀造環(huán)境中結(jié)合態(tài)風(fēng)味前體的釋放情況等。

[1]BergerRG.Advancesinbiochemicalengineering biotechnology：Biotechnology of aroma compounds[M].Berlin：Springer，1997.

[2]Abbott N A，Coombe B G，Williams P J.The contribution of hydrolyzed flavor precursors to quality differences in shiraz juice and wines-an investigation by sensory descriptive analysis[J]. AmericanJournalofEnologyandViticulture，1991，42（3）：167-174.

[3]Francis I，Sefton M，Williams P.A study by sensory descriptive analysis of the effects of oak origin，seasoning，and heating on the aromas of oak model wine extracts[J].American Journal of Enology and Viticulture，1992，43（1）：23.

[4]Barbagallo R N，Spagna G，Palmeri R，et al.Selection，characterization and comparison of β-glucosidase from mould and yeasts employable for enological applications[J].Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：58-66.

[5]Liebig J，Wohler F.The composition of bitter almonds[J]. Annalen，1837，22（1）：1-24.

[6]Feldwisch J，Vente A，Zettl R，et al.Characterization of two membrane-associated β-glucosidases from maize（Zea mays L.）coleoptiles[J].Biochemical Journal，1994，302（Pt 1）：15.

[7]Palmeri R，Spagna G.β-Glucosidase in cellular and acellular formforwinemakingapplication[J].EnzymeandMicrobial Technology，2007，40（3）：382-389.

[8]Villena M A，Iranzo J F U＇，Pérez A I B.β-Glucosidase activity in wine yeasts：Application in enology[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，40（3）：420-425.

[9]McMahon H，Zoecklein B，F(xiàn)ugelsang K，et al.Quantification of glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，1999，23（3）：198-203.

[10]Wang Y，Li J，Xu Y.Characterization of novel β-glucosidases with transglycosylation properties from Trichosporon asahii[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（20）：11219-11227.

[11]Faia A M，F(xiàn)erreira A M，Climaco M C.The role of non-Saccharomyces species in releasing glycosidic bound fraction of grape aroma components-a preliminary study[J].Journal of Applied Microbiology，2001，91（1）：67-71.

[12]M Gra?a da Silveira M V S R，Maria C Loureiro-Dias，F(xiàn)rans M Rombouts，et al.Flow cytometric assessment of membrane integrity of ethanol-stressed Oenococcus oeni cells[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68（12）：6087-6093.

Effect of oenological factors on the productions of β-glucosidases from wild yeasts

WANG Yu-xia1，ZHANG Chao2，*
（1.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，School of Life Science and Food Engineering，Institute for Bioengeering，Yibin University，Yibin 644000，China；2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，School of Life Science and Food Engineering，Institute for Food Science and Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China）

The main objective of this study was to investigate the potential applications of wild yeast strains by assaying the enzyme production under simulated oenological conditions.The results indicated that most βglucosidases were intracellular activity.The highest total activity of H.uvarum was detected，0.51U/mL.A remarkable variability in the effects of oenological factors on the production of β-glucosidase were observed among yeast strains.The significant inhibitions on the β-glucosidase productions were observed under high sugar and low pH conditions.The strongest inhibition on P.fermentans was observed，for 63.50%～84.32%inhibition in comparion with control at pH 3.0，followed by Saccharomyces and Hanseniaspora.Furthermore，H.uvarum exhibited highest β-glucosidase production under the low pH conditions.Under the low concentration of alcohol（5%），the productions of yeast β-glucosidase were increased.But the β-glucosidases production decreased with increasing the concentration of alcohol，even no β-glucosidase activity could be detected for P.fermentans strain.In conclusion，the better performances endowed H.uvarum strain some potential application.

wine yeast；β-glucosidase；oenological factors

TS261.4

A

1002-0306（2014）14-0205-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.037

2014－01－06*通訊聯(lián)系人

王玉霞（1974-），女，博士，講師，研究方向：釀造工藝與微生物。

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZA0197）；博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2012B17）；發(fā)酵與資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2011KFZ002）。