任曉靜，奚印慈，洪怡藍(lán)，陳 潔，徐文斌（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

甜葉菊提取物抑菌作用的研究

任曉靜，奚印慈*，洪怡藍(lán)，陳 潔，徐文斌
（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

對甜葉菊提取物的抑菌作用進(jìn)行了研究。采用打孔法對甜葉菊提取物進(jìn)行細(xì)菌敏感性測試，二倍稀釋法測定最低抑菌濃度，同時研究了pH、紫外光、溫度對甜葉菊提取物抑菌效果的影響。結(jié)果表明：甜葉菊提取物具有很強(qiáng)的抑菌作用，明顯強(qiáng)于山梨酸鉀，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為8.4、8.4、4.2mg/mL。甜葉菊提取物的抑菌效果在pH為3～5時良好；紫外光照射使其對大腸桿菌的抑制作用明顯減弱，對金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌的抑制作用無顯著性變化；121℃、30min加熱處理對其抑菌效果無顯著性影響。研究表明，甜葉菊生物制劑是一種前景廣闊的新型、天然防腐劑。

甜葉菊提取物，抑菌，最低抑菌濃度

甜葉菊是一種菊科宿根多年生草本植物，屬雙子葉植物綱，它原產(chǎn)于南美巴拉圭東部，當(dāng)?shù)厝朔Q它為“巴拉圭甜茶”，又名“甜草”[1-3]，現(xiàn)已在中國和東南亞得到了成功栽培。從它的1kg葉片中可提取出60～70g左右的甜菊苷結(jié)晶，其甜度為蔗糖的300倍，而熱能僅為其九十分之一，食用安全，是備受推崇的天然糖源。甜葉菊中含有類黃酮、生物堿、水溶性葉綠素、葉黃素以及中性的水溶性低聚糖、自由糖、氨基酸、脂質(zhì)[3-5]等。同時，它具有高甜度、低熱量、無毒、無副作用等特點，經(jīng)常食用可預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病等病癥[6-9]，已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業(yè)。

于慧等選擇移植中國的南美甜葉菊在生產(chǎn)糖苷時剩余殘渣為原料，經(jīng)不同工藝制得三種生物制劑，分別采用清除DPPH自由基法、氧自由基吸收能力（ORAC）法和過氧化值（POV）法研究其抗氧化能力。結(jié)果表明：三種生物制劑均具有一定的DPPH自由基清除能力，且隨著濃度增加，其清除能力逐漸增強(qiáng)[10]。于慧等對甜葉菊生物發(fā)酵制劑的強(qiáng)抗氧化活性成分進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，確定多酚類物質(zhì)是甜葉菊生物發(fā)酵制劑強(qiáng)抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。此外，研發(fā)者對甜葉菊的多種生物活性進(jìn)行了多方面的研究，發(fā)現(xiàn)了其具有抗氧化、抗過敏等多種生物活性[12-13]，但關(guān)于甜葉菊抑菌性的研究較少，本實驗旨在探討甜葉菊提取物的抑菌作用，為甜葉菊的綜合利用及新型天然食品防腐劑的研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄菌（Staphylococcus aureus）ACCC01170、大腸桿菌（Escherichia coil）ACCC 0169、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ACCC 01336 菌種均來自微生物菌種保藏中心；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、國產(chǎn)生化試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；山梨酸鉀 食品級，上海順意豐速運(yùn)有限公司。

DGG-9203AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；WP800TL23-K3型微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司；JH1102型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DSX-280B型不銹鋼自動手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BCM型生物潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司；THZ-300型恒溫培養(yǎng)搖床、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、LRH-250CL型低溫生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；HWT-20C型恒溫振蕩水浴 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜葉菊提取物的制備 甜葉菊→浸泡→水萃取→分離→濃縮→制得原液[10]質(zhì)量濃度為0.21g/mL）。

1.2.2 菌懸液的制備 用無菌接種環(huán)挑取活化過的試管斜面上的菌落，接種到含有10mL營養(yǎng)肉湯的試管中，用漩渦混合儀混勻后于37℃下振蕩培養(yǎng)12h，調(diào)整供試菌懸液的濃度，使其達(dá)到106～107個/mL備用。

1.2.3 打孔法測定甜葉菊提取物抑菌作用[14-15]取各種供試菌懸液0.1mL于相應(yīng)的平皿上，用L棒將菌懸液涂布均勻，用滅過菌的打孔器在培養(yǎng)皿中十字對稱打孔，注入50μL甜葉菊提取物溶液，將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定抑菌圈直徑[16-17]，同時設(shè)置無菌水陰性對照和山梨酸鉀陽性對照。

1.2.4 二倍稀釋法測定甜葉菊提取物最低抑菌濃度[14，18]采用二倍稀釋法使?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中甜葉菊提取物濃度分別為8.4、4.2、2.1、1.1、0.55及0.28mg/mL，然后分別與0.1mL菌懸液混合均勻，從無菌生長的培養(yǎng)基中找出提取物濃度最低的培養(yǎng)基，即為該甜葉菊提取物的最低抑菌濃度[14，17]。同時設(shè)置無菌水陰性對照和同等質(zhì)量濃度的山梨酸鉀陽性對照。

1.2.5 抑菌率實驗 調(diào)整營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中甜葉菊提取物的濃度為最低抑菌濃度，與0.1mL菌懸液混合均勻，37℃下分別培養(yǎng)0.5、1、1.5、2h后，取1mL混合液涂平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后統(tǒng)計菌落形成個數(shù)，以菌懸液直接稀釋涂平板的菌落數(shù)作為起始值，以此計算抑菌率[14，19，20]。

1.2.6 pH對甜葉菊提取物抑菌效果的影響 用酸堿溶液調(diào)節(jié)pH，分別制成pH為3、4、5、6、7、8的系列培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基中甜葉菊提取物的濃度為最低抑菌濃度，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為指示菌測定其抑菌效果[21-22]。實驗重復(fù)三次。

1.2.7 紫外光照射對甜葉菊提取物抑菌效果的影響 甜葉菊提取物置于功率為15W紫外燈下分別照射10、20、30、40、50、60、70min，調(diào)整培養(yǎng)基中甜葉菊提取物的濃度為最低抑菌濃度，與0.1mL菌懸液混合均勻[14]，冷卻凝固后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察菌落數(shù)[23-24]。實驗重復(fù)三次。

1.2.8 溫度對甜葉菊提取物抑菌效果的影響 甜葉菊提取物分別在20、80、90、121℃下加熱處理15min，調(diào)整培養(yǎng)基中甜葉菊提取物的濃度為最低抑菌濃度，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為指示菌測定其抑菌效果[25-27]。實驗重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜葉菊提取物抑菌作用

從表1可以看出，甜葉菊提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的平均抑菌圈直徑分別為5.85、3.42、7.74mm。相同質(zhì)量濃度0.21g/mL下，山梨酸鉀對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌幾乎沒有抑制作用，對大腸桿菌平均抑菌圈直徑為2.00mm。因而可以得出結(jié)論，相同質(zhì)量濃度下，甜葉菊提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯強(qiáng)于山梨酸鉀。對三種供試菌種的抑制效果在山茱萸提取物中也有報道[28]，山茱萸提取物對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用小于對金黃色葡萄球菌的抑制作用，而甜葉菊提取物在這方面顯示出特有的優(yōu)勢，這為今后天然防腐劑的選擇提供了不同方向。

表1 甜葉菊提取物的抑菌圈直徑（mm）Table 1 Antimicrobial circle diameter of extraction from stevia rebaudiana（mm）

表2 甜葉菊提取物最小抑菌濃度（mg/mL）Table 2 Minimum inhibitory concentration of extraction from stevia rebaudiana（mg/mL）

2.2 甜葉菊提取物最低抑菌濃度的確定

從表2可以看出，甜葉菊提取物濃度越高抑菌作用越強(qiáng)，具有量效關(guān)系。甜葉菊提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為8.4、8.4、4.2mg/mL，尤其是對枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制效果。而相同質(zhì)量濃度下，山梨酸鉀的抑菌作用不明顯。

2.3 抑菌率

從圖1可以看出，在最低抑菌濃度下，甜葉菊提取物在培養(yǎng)0.5h時對大腸桿菌（Ec）、金黃色葡萄球菌（Sa）及枯草芽孢桿菌（Bs）的抑菌率分別為91.4%、88.8%、100%，1h時對三種細(xì)菌的抑菌率分別為92.9%、91.7%、100%，隨著時間的延長，抑菌率變化趨于平緩。相同質(zhì)量濃度下，山梨酸鉀在2h時對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別是40.5%、38.5%、35.8%。因而可以得出結(jié)論，相同質(zhì)量濃度下，甜葉菊提取物的抑菌率明顯高于山梨酸鉀。

圖1 甜葉菊提取物抑菌率的測定Fig.1 Inhibitory rate of extraction from stevia rebaudiana

2.4 pH對甜葉菊提取物抑菌效果的影響

表3顯示，不同pH條件下，甜葉菊提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌的抑菌效果表現(xiàn)出一致的規(guī)律。當(dāng)pH≤4.0時，培養(yǎng)基上沒有菌落生長，表明大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌受到完全的抑制；當(dāng)pH≥5.0時，甜葉菊提取物抑菌效果會逐漸降低?？赡茉蚴?，pH升高，改變了提取物有效抑菌成分結(jié)構(gòu)，而在弱酸的環(huán)境下甜葉菊提取物的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的抑菌活性。這一特點提示，甜葉菊提取物作為防腐劑添加在食品中，在弱酸性環(huán)境中抑菌活性較強(qiáng)。

表3 pH對甜葉菊提取物抑菌活性的影響Table 3 Effect of pH on antibacterial activity of extraction from stevia rebaudiana

2.5 紫外光照射對甜葉菊提取物抑菌效果的影響

從表4可以看出，紫外光照射使甜葉菊提取物對大腸桿菌的抑制作用明顯減弱，而對金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌的抑制作用基本不受影響。由此看出，對于不同菌種，紫外光對甜葉菊提取物的抑菌活性具有不同影響，推測原因為甜葉菊提取物對不同菌種的抑菌機(jī)制存在差異。這一特點提示，環(huán)境中的紫外線的存在和長時間照射可能會影響到甜葉菊提取物抑菌性能的發(fā)揮。

2.6 溫度對甜葉菊提取物抑菌效果的影響

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，測定不同溫度下甜葉菊提取物的抑菌活性。由表5可以看出，甜葉菊提取物經(jīng)不同溫度處理后抑菌效果均沒有明顯的差異，表明甜葉菊提取物中的抑菌成分具有良好的熱穩(wěn)定性，即使經(jīng)過121℃、30min的處理后，其抑菌效果也無顯著性差異，這與郝淑賢得出荸薺英提取物具備良好抗熱性的結(jié)論一致[29]。這一熱穩(wěn)定性的特點提示：甜葉菊提取物即使添加于需進(jìn)行加熱處理的食品中，也可穩(wěn)定保持其抗菌防腐性能，可作為熱加工食品中的防腐劑。這一特性對其今后的應(yīng)用具有重要的意義。

表5 溫度對甜葉菊提取物抑菌活性的影響Table 5 Effect of temperature on antibacterial activity of extraction from stevia rebaudiana

表4 紫外光線對甜葉菊提取物抑菌活性的影響Table 4 Effect of ultraviolet radiation on antibacterial activity of extraction from stevia rebaudiana

3 結(jié)論與討論

通過對甜葉菊提取物抑菌作用的研究表明，甜葉菊提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有良好的抑菌性，明顯強(qiáng)于山梨酸鉀。甜葉菊提取物的抑菌活性具有量效關(guān)系，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度分別為8.4、8.4、4.2mg/mL。

甜葉菊提取物的抑菌效果在弱酸性條件下較強(qiáng)，紫外光照使甜葉菊提取物對大腸桿菌的抑制作用明顯減弱，應(yīng)盡量減少甜葉菊提取物在空氣中的暴露時間，溫度對甜葉菊提取物的抑菌效果不存在影響。總體上看，甜葉菊提取物抑菌活性較穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響較小。如將甜葉菊提取物應(yīng)用于食品的防腐保鮮，其能夠適應(yīng)不同食品的加工環(huán)境，從而起到延長食品保質(zhì)期的目的。

隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的不斷升高，人們的健康飲食意識的不斷加強(qiáng)，食品加工和貯藏過程中，越來越傾向于使用天然防腐抑菌劑。本研究以山梨酸鉀為對照，研究了甜葉菊提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)甜葉菊提取物具有很強(qiáng)的抑菌活性，其熱穩(wěn)定性良好。作為一種天然抑菌物質(zhì)，必然具有廣闊的發(fā)展前景。在對甜葉菊提取物的抑菌性作了初步探究的同時，我們還在繼續(xù)關(guān)注并研究甜葉菊提取物中具有抗菌活性的主要成分，力求解明甜葉菊提取物的抑菌機(jī)理，為食品安全提供保證。

[1]王飛生，葉榮飛，閔建，等.甜菊糖苷的特性及應(yīng)用[J].中國調(diào)味品，2009，34（10）：91-95，117.

[2]丁寧，郝再彬，陳秀華，原益山.甜葉菊及其糖苷的研究與發(fā)展[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2005（4）：8-10.

[3]楊全花，陳光，任紅梅，等.甜葉菊化學(xué)成分及其甜度的研究[J].北京化工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，39（2）：28-32.

[4]Brahmachari G，Mandal L C，Roy R，et al.Stevia Rebaudiana Extract and related compounds-molecules of phmarmaceutical promise：a critical overview[J].Arch Pharm Chem Life Sci，2011，29（1）：5-19．

[5]徐學(xué)兵.油脂化學(xué)[M].北京：中國商業(yè)出版社，1993.

[6]李文林，黃鳳洪.天然抗氧化劑研究現(xiàn)狀[J].糧食與油脂，2003（10）：10-13.

[7]奚印慈，山口敏康，佐藤實，等.ステビアの抗酸化性[J].日本食品科學(xué)工學(xué)會誌，1998，45（5）：310-316.

[8]広海輝明.肝誀の特効食 “ステビア草”C型肝炎あきらめたら一生の損[M].東京：青萠堂株式會社，2001.

[9]広海輝明.糖尿病は治る[M].東京：総合法令出版株式會社，2002.

[10]于慧，王錫昌，奚印慈.甜葉菊廢棄物制得生物制劑的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2008，29（8）：65-69.

[11]于慧，王錫昌，宋仁政，奚印慈.甜葉菊生物發(fā)酵制劑抗氧化成分的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（10）：46-49.

[12]于梅，寧杰，樸美子.甜葉菊抗氧化果凍的研制[J].食品與發(fā)酵科技，2011，47（3）：24-27.

[13]奚印慈，山口敏康，佐藤實，等.ステビア抽出末の抗酸化機(jī)構(gòu)と無機(jī)塩の抗酸化性[J].日本食品科學(xué)工學(xué)會誌，1998，45（5）：317-322.

[14]楊聞，段玉峰，王蓓蓓，等.首烏藤總黃酮的抑菌活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（9）：111-113.

[15]劉夢茵，劉芳，周濤，等.烏梅乙醇提取物抑菌作用及其抑菌成分分析[J].食品科學(xué)，2011，32（17）：190-193.

[16]林亮.化香樹果序黃酮類化合物提取、分離及抗菌活性研究[D].西安：西北大學(xué)，2009.

[17]陳佳佳，劉凡，廖森泰，等.桑葉提取物抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（9）：88-91.

[18]馮仁豐.食品實用醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)[M].上海：科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

[19]Pettit Robin K，F(xiàn)akoury.Antibacterial activity of the marine sponge on stituent cribrostatin[J].Medical Microbiology，2004，53（1）：61-65.1-7[2012/6/7].http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1759. TS.20111018.1015.011.html

[20]王延峰，李延清，封德順，等.超聲法提取銀杏葉黃酮的研究[J].食品科學(xué)，2002，23（8）：166-167.

[21]劉冬梅，李理，梁世中，等.用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（3）：110-111.

[22]呼世斌，馮貴穎，曹社會.山茱萸的營養(yǎng)成分及保健作用[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，24（6）：108-110.

[23]盧成英，徐東翔，杜勇，等.檵木葉抑菌活性成分提取分離與檢測[J].中成藥，2006，28（1）：132-134.

[24]程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

[25]王兆慧.常用化學(xué)消毒劑對細(xì)菌的作用效果評價[J].哈爾濱學(xué)院學(xué)報，2001，22（5）：41-42.

[26]李鳴宇，朱彩蓮，劉正.藥物牙膏對部分口腔細(xì)菌抑制作用的體外實驗[J].廣東牙病防治，2004，12（1）：24-26.

[27]湯文成.將牙膏、香皂納入化妝品衛(wèi)生監(jiān)督管理之我見[J].中國衛(wèi)生法制，2002，10（5）：27-28.

[28]趙淑艷，呼世斌，吳煥利，唐艷，王顯蕾.山茱萸提取物抑菌活性成分穩(wěn)定性的研究[J].食品科學(xué)，2008，29（1）：98-101.

[29]郝淑賢，劉欣，趙力超，等.荸薺英提取物抑菌成分穩(wěn)定性的探討[J].食品科學(xué)，2005，26（2）：71-74.

Study on antibacterial effect of extraction from stevia rebaudiana

REN Xiao-jing，XI Yin-ci*，HONG Yi-lan，CHEN Jie，XU Wen-bin
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The antibacterial effect of extraction from stevia rebaudiana was studied.Punch method was used to make bacterial susceptibility test for the extraction from stevia rebaudiana，and double-dilution method was used to test minimum inhibitory concentration.Besides，the influence of pH，ultraviolet radiation and temperature on the antibacterial effect of the extraction was also studied.The result showed that the extraction’s minimum concentration to inhibit Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were 8.4，8.4 and 4.2mg/mL respectively with the stronger antibacterial effect than potassium sorbate.pH3～5 was suitable for the extraction to inhibit bacteria.The extraction from stevia rebaudiana showed loss of antibacterial effect to Escherichia coli after treated with ultraviolet while ultraviolet had little effect to Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. Atimicrobial activity was not changed obviously by heating at 121℃ for 30min.It showed that extraction from stevia rebaudiana was a novel，nature preservative.

stevia rebaudiana；antibacterial；minimum inhibitory concentration

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0174-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.030

2013-11-11 *通訊聯(lián)系人

任曉靜（1988-），女，碩士研究生，研究方向：天然物質(zhì)生物活性。

上海海洋大學(xué)-日本維科株式會社合作研究基金項目（D8006-080002）。