李文婕，楊小明，*，張赫男，李世超，方洋洋（.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江03；.江蘇大學化學化工學院，江蘇鎮(zhèn)江03）

無花果多糖的純化及其抗氧化活性研究

李文婕1，楊小明1，*，張赫男1，李世超1，方洋洋2
（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學化學化工學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：探討無花果多糖（Ficus carica polysaccharides，F(xiàn)CPS）的分離純化及其抗氧化活性。方法：采用水提醇沉法提取，Sevage法除蛋白、膜過濾后凍干得到無花果多糖，再經(jīng)DEAE-52纖維素柱純化；以UV等方法考察多糖的理化性質(zhì)，高效凝膠色譜測定多糖的純度和相對分子質(zhì)量分布；并研究其抗氧化活性。結果：經(jīng)水提醇沉、膜過濾后得到的FCPS為混合酸性多糖，不含蛋白質(zhì)、核酸，分子量范圍在5.92×105～2.0×106u之間；DEAE-52柱分級得到FCPS的三個餾分：FCPS1、FCPS2和FCPS3，高效凝膠色譜分析顯示FCPS2為一對稱峰，分子量約為2.61×106u?？寡趸钚詫嶒烇@示清除超氧負離子能力IC50FCPS2為430滋g/mL，F(xiàn)CPS為620滋g/mL；清除羥基自由基IC50FCPS2為1000滋g/mL，F(xiàn)CPS為4780滋g/mL。在濃度為1000滋g/mL時，F(xiàn)CPS2和FCPS的還原能力分別為0.055和0.133。結論：FCPS經(jīng)純化后得到的組分FCPS2較FCPS表現(xiàn)出更好的清除超氧負離子和清除羥基自由基的能力，但還原能力有所降低。

無花果多糖，分離純化，抗氧化

抗氧化作用一直以來是醫(yī)學研究的重要環(huán)節(jié)，許多慢性病如心腦血管疾病、糖尿病、高血壓以及腫瘤等疾病，主要是由于人體內(nèi)過量的自由基引發(fā)氧化應激，從而造成細胞損傷所致。天然抗氧化活性成分能夠清除自由基，避免細胞由于自由基的作用而被老化、損傷或產(chǎn)生DNA突變，從而達到保護機體的作用[1]。因此研究食物中的抗氧化活性成分，對于有效地指導人們合理利用膳食、提高人體抗病能力、促進人類健康和延長人類壽命具有重要意義。

無花果是一種可食率高達92%以上的漿果，含有豐富的糖類、蛋白、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，其中以多糖的功效尤為引人關注。據(jù)目前已有的研究表明，無花果多糖具有抗腫瘤[2]、提高免疫力[3]、降血糖[4]、降血脂[4]等功效。楊小明等[5]發(fā)現(xiàn)無花果粗多糖顯示出良好的抗氧化活性。為了深入了解無花果多糖中的抗氧化活性組分，本研究擬對無花果多糖進行分級純化，并檢測其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無花果 由江蘇省豐縣中研無花果開發(fā)有限公司提供，品種為日本紫果，壓榨取汁后得到殘渣，經(jīng)45℃烘干，粉碎過20目篩備用；DEAE-52纖維素交換樹脂（柱層析用） 上海國藥集團進口分裝；NBT、NADH、濃硫酸、無水乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、丙酮、NaCl、NaOH、HCl等試劑 上?；瘜W試劑有限公司；提取用水 為二次蒸餾水；分析用水 為娃哈哈純凈水。

高效液相系統(tǒng) ProStar210泵、ProStar 355 RI檢測器，美國VARIAN公司；BS-124S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52C型旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-D型循環(huán)水式多用真空泵、HH-S型水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；Pellicon小型超濾系統(tǒng) 美國Millipore公司；ALPHA2-4型冷凍干燥機 德國CHRIST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無花果多糖的提取 根據(jù)文獻[6]的實驗方法略加修改：50g干燥無花果渣粉以石油醚脫脂三次后加入500mL蒸餾水，于100℃提取180min，過濾，濾渣重復提取一次，合并濾液。將濾液濃縮至原體積的1/4后，Sevage法除蛋白，經(jīng)6次脫蛋白后，在攪拌條件下，緩慢加入四倍體積的無水乙醇沉淀，于4℃靜置12h，離心分離，收集沉淀，即得無花果粗多糖。

無花果粗多糖加水溶解，用截留分子量為10ku的平面纖維素超濾膜超濾（ΔP=0.1MPa，T=25℃），收集分子量大于10ku部分，在60℃以下濃縮至原體積的1/4，攪拌下慢慢加入無水乙醇至75%濃度，4℃靜置12h，離心（3000r/min，20min）分離，沉淀以無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥，得無花果多糖（FCPS）。

1.2.2 無花果多糖理化性質(zhì)分析

1.2.2.1 無花果多糖性狀及理化性質(zhì) 參照文獻[6]對無花果多糖進行外觀及溶解性、碘-碘化鉀反應、Molish試劑反應、茚三酮反應、紫外光譜檢測等驗證分析。

總糖含量測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準單糖；蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法，以牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.2.2.2 無花果多糖等當點測定 準確稱取105℃干燥恒重的無花果多糖樣品0.15g于100mL的三角燒瓶中，加入20mL蒸餾水及0.057mol/L標準HCl溶液20mL，在室溫下溶解。磁力攪拌下用0.054mol/mL標準NaOH滴定。每滴入1mL NaOH溶液測定pH一次。以加入的NaOH溶液體積為橫坐標，測得的pH為縱坐標繪圖，找出曲線突躍點對應的pH即為無花果多糖的等當點。

1.2.3 無花果多糖的分級分離 取150mg無花果多糖溶于10mL熱蒸餾水中，充分溶解后離心，取上清液加入層析柱（Φ1.0×50cm，DEAE-52高45cm）上，洗脫梯度為蒸餾水、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L NaCl溶液，流速0.3mL/min，每30min收集一管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖洗脫情況，以管號為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線，合并同一洗脫峰的洗脫液。透析（10ku cut-off）脫鹽，真空干燥（45℃、≥0.095MPa）。

1.2.4 無花果多糖的純度鑒定及分子量分布測定 凝膠色譜條件：糖柱為TSK-GEL G4000PW（TOSOH CORPORATION）。流動相：娃哈哈純凈水，流速0.5mL/min，柱溫（35±0.1）℃。

用標準葡聚糖Dextran T系列（分子量104、4×104、7×104、5×105和2×106u標準葡聚糖）制作標準曲線，然后根據(jù)多糖樣品在相同的色譜條件下的洗脫體積或保留時間，從標準曲線上求出該樣品的分子量。

1.2.5 無花果多糖及其餾分抗氧化活性研究

1.2.5.1 清除超氧負離子的能力 采用PMS-NADHNBT體系[7]。反應體系：1.5mL不同濃度樣品溶液（溶解于Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L），0.5mL氯化硝基四氮唑NBT（300μmol/L溶解于Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L），0.5mL還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH（468μmol/L溶解于Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L），加入0.5mL吩嗪硫酸二甲酯PMS（60μmol/L）啟動反應，25℃水浴5min，空白對照為樣品代替為緩沖溶液（Tris-HCl，pH8.0，16mmol/L）反應完成于560nm測定，結果計算按以下公式進行。

式中：SE-清除超氧負離子的能力（Scavenging effect）；A1-樣品測試值；A0-空白值（緩沖液代替樣品）。

1.2.5.2 清除羥基自由基的能力[8-9]取1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中依次加入2mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.40）和1mL蒸餾水，充分混勻后，加入1mL 0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液（FeSO4），混勻后，加入1mL 0.01%雙氧水（H2O2），于37℃水浴60min后，在536nm測其吸光值，所測得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光值A損。未損傷管以1mL蒸餾水代替損傷管中1mL 0.01%的雙氧水（H2O2），操作方法同損傷管，可測得536nm未損傷管的吸光值A未。樣品管以1mL樣品代替損傷管中的1mL蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得536nm樣品管的吸光值A樣。清除率I的計算公式：

1.2.5.3 還原能力[10-11]1mL樣品測試液，加入2.5mL PBS（0.2mol/L，pH6.6）和2.5mL鐵氰化鉀（1%），混合均勻，50℃反應20min。接著加入2.5mL三氯乙酸（10%），進行離心（2000r/min，10min），吸取上清液2.5mL與0.5mL FeCl3（0.1%）混合，在700nm處測定吸光度。溶液的吸光度越高，表示還原能力越強。

2 結果與討論

2.1 無花果多糖的理化性質(zhì)

2.1.1 無花果多糖表觀性狀 無花果粉末經(jīng)水提醇沉、脫蛋白、脫除小分子雜質(zhì)、冷凍干燥，得到無花果多糖，其外觀為淺灰色疏松狀粉末，無味，易溶于水，水溶液pH4.2，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑。碘-碘化鉀反應呈陰性，說明所得產(chǎn)品中不含淀粉；茚三酮反應呈陰性，說明所得產(chǎn)品中不含有蛋白質(zhì)；其紫外光譜驗證，無花果多糖在260、280nm處沒有蛋白質(zhì)、核酸的特征吸收；192nm處有明顯的吸收峰，表現(xiàn)為糖的特征吸收（見圖1）。Molish反應呈陽性，說明所得產(chǎn)品中含有糖類物質(zhì)。根據(jù)公式計算得無花果多糖的得率為4.1%，按苯酚-硫酸法測得總糖含量為91%。

圖1 無花果多糖的紫外光譜Fig.1 UV Spectrum of FCPS

2.1.2 等當點測定[12]等當點（equivalent point）是當?shù)渭拥臉藴嗜芤汉捅粶y物質(zhì)恰好反應時，這一時刻稱為等當點。測定多糖的等當點可以更好地了解多糖的酸堿性。

圖2 FCPS等當點滴定曲線Fig.2 The titration curve of determine FCPS equivalent point

在酸堿中和滴定中，到達等當點時溶液不一定都是中性的，有時呈酸性、有時呈堿性，這要看中和后生成鹽的性質(zhì)。強酸和強堿的中和滴定，在等當點時溶液呈中性；強堿滴定弱酸，因生成的鹽又要水解，在等當點時溶液呈堿性；同理，強酸滴定弱堿，在等當點時溶液呈酸性。FCPS等當點測定結果見圖2，可知FCPS等當點為6.92，因此FCPS是弱酸性的多糖。

2.1.3 分子量測定 分別采用分子量為104、4×104、7×104、5×105和2×106u標準葡聚糖按分析條件進樣，記錄各分子量葡聚糖的保留時間RT，以分子量對數(shù)為縱坐標，RT為橫坐標作圖（見圖3），采用最小二乘法回歸得到葡聚糖分子量M與RT的對應回歸方程：LgM=9.6188－0.3246RT，r=0.9947。

將FCPS樣品在同樣條件下進樣，其分析圖譜呈現(xiàn)出現(xiàn)一系列高低不等的峰值，這表明FCPS是混合多糖。將其最初及最終出峰時間，帶入標準曲線計算，得知無花果多糖的分子量分布范圍在5.92×105～2.0×106u之間。

圖3 排阻色譜法分子量分布測定標準曲線（Mean±SD，n=3）Fig.3 The calibration curve of the dextran series in HPGPC（Mean±SD，n=3）

2.2 無花果多糖的分級純化

由于FCPS為混合多糖，為了獲得FCPS的均一性組分，采用DEAE-52離子交換樹脂對FCPS進行分離，采用0、0.1、0.2、0.3和0.4mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，洗脫液以苯酚-硫酸法追蹤多糖，分析結果見圖4。從圖4可知，當NaCl濃度為0、0.1和0.2mol/L時，分別有一多糖餾分出現(xiàn)，各自標記為FCPS1、FCPS2和FCPS3；NaCl洗脫液濃度達到0.3和0.4mol/L時，未見由多糖洗脫峰出現(xiàn)。

圖4 FCPS經(jīng)DEAE-52柱層析色譜圖（Mean±SD，n=3）Fig.4 Elution curve of FCPS on DEAE-52（Mean±SD，n=3）

2.3 FCPS2高效液相凝膠色譜分析和分子量測定

采用高效液相凝膠色譜（HPGPC）對FCPS的三個餾分進行分析，結果可知在純化得到的三個餾分中，僅FCPS2在高效液相凝膠色譜分析圖中出現(xiàn)單一且基本對稱的單峰，如圖5所示，若要進一步確定FCPS2為均一多糖組分，可采用高壓電泳、超離心等方法來輔助驗證，這一實驗待以后進一步完成。FCPS2的保留時間約為9.866min，帶入分子量標準曲線，計算得知FCPS2分子量為2.61×106u。

2.4 FCPS2的體外抗氧化研究

2.4.1 清除超氧陰離子自由基的能力的測試 超氧陰離子自由基是常見的自由基之一，具有較強的氧化能力，在檢驗抗氧化物質(zhì)的活性時經(jīng)常把清除超氧陰離子自由基作為其中一個重要的指標。本實驗的原理是PMS與NADH作用產(chǎn)生超氧陰離子，NBT再利用其還原生成在560nm處有最大吸收的物質(zhì)，考察560nm吸光度的變化來得知超氧陰離子的被清除率，吸光值越低，表示清除率越高。

FCPS2對超氧陰離子的清除活性如圖6所示。在終濃度為500滋g/mL時對超氧陰離子的清除效率約為50.3%，其IC50為430滋g/mL，根據(jù)本實驗組的實驗結果，F(xiàn)CPS清除超氧陰離子的IC50為620滋g/mL。結果表明純化后得到的多糖組分FCPS2清除超氧陰離子能力比FCPS強。

圖5 FCPS2的HPGPC色譜圖Fig.5 HPGPC chromatograms of FCPS2

圖6 FCPS2、FCPS清除超氧陰離子自由基的能力（Mean±SD，n=3）Fig.6 Scavenging activity of FCPS2 and FCPS on superoxide anion radicals（Mean±SD，n=3）

2.4.2 清除羥基自由基能力的測試 羥基自由基（·OH）是一種十分活潑的活性氧，氧化能力很強。因鄰二氮菲-Fe2+溶液（橙紅色）被反應生成的·OH氧化成鄰二氮菲-Fe3+，在536nm波長處的最大吸收峰消失，故可以根據(jù)用鄰二氮菲-Fe2+的褪色程度來衡量·OH的清除率。

將FCPS2配成不同濃度，根據(jù)1.2.5.2的方法測定其對羥基自由基的清除率，結果如圖7所示?？芍?，F(xiàn)CPS2在體外有一定的清除羥基自由基能力，并隨著其濃度的增加清除能力逐漸增強，其IC50約為1000滋g/mL，而根據(jù)本實驗組實驗結果，無花果多糖清除羥基自由基的IC50為4780滋g/mL。表明純化后得到的多糖組分FCPS2清除羥基自由基能力比FCPS強，這與清除超氧負離子能力測試結果一致。

圖7 FCPS2、FCPS清除羥基自由基的能力（Mean±SD，n=3）Fig.7 Activity scavenging hydroxyl radical of FCPS2 and FCPS（Mean±SD，n=3）

2.4.3 還原能力測試 多糖的還原能力與抗氧化活性有明顯關系。抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子從而清除自由基。還原能力越強，抗氧化活性越強。在鐵氰化鉀體系中，F(xiàn)e3+在抗氧化劑的促進下被還原為Fe2+，形成的Fe2+在700nm處檢出。測定的吸光度值越大，還原能力越強。

FCPS2的還原能力測定結果見圖8。由圖8可見，F(xiàn)CPS2顯示出一定的還原能力，并隨著濃度的增加，還原能力逐漸增強。在濃度為1000滋g/mL時，F(xiàn)CPS2和FCPS的還原能力分別為0.055和0.133，F(xiàn)CPS2還原能力遠低于FCPS。多糖的還原力與其單糖的還原末端暴露的多少有關，我們推測純化后的單糖組分還原末端暴露估計很少，直接影響到了其還原能力。

FCPS2具有還原鐵離子的能力，還原能力隨濃度的增加而增加，而且它還具有抑制自由基轉移電子的能力，能夠使自由基轉變成更穩(wěn)定的產(chǎn)物從而終止自由基一系列的反應。

通過清除超氧陰離子的能力的測試、清除羥基自由基能力的測試和還原能力測試三個方面的實驗結果表明，純化后的FCPS2的抗氧化活性明顯強于FCPS。這是因為，多糖的活性與分子量、溶解度、粘度、初級結構和高級結構有關，多糖分子量越大，分子體積越大，不利于跨膜進入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學活性，小分子量的多糖更容易結合活性位點，而分子量過低，又無法形成活性的聚合結構。分子量適當大小的多糖，其活性較高[13]。

圖8 FCPS2、FCPS的還原能力（Mean±SD，n=3）Fig.8 Reducing power of FCPS2 and FCPS（Mean±SD，n=3）

3 結論

FCPS經(jīng)柱層析獲得三個組分：FCPS1、FCPS2、FCPS3，其中初步驗證出FCPS2為均一性組分，分子量約為2.61×106u。實驗研究了FCPS2的抗氧化活性，實驗顯示清除超氧陰離子自由基能力IC50FCPS2為430滋g/mL，而FCPS為620滋g/mL；清除羥基自由基IC50FCPS2為1000滋g/mL，F(xiàn)CPS為4780滋g/mL。在濃度為1000滋g/mL時，F(xiàn)CPS2和FCPS的還原能力分別為0.055和0.133。因此，F(xiàn)CPS2表現(xiàn)出了比FCPS更好的清除超氧陰離子自由基和清除羥基自由基的能力，但FCPS2的還原能力較FCPS低。

[1]杜芹芹，張旭，宋鳳瑞，等.人參與附子、黃連配伍的HPLCESI-MS研究及抗氧化活性測定[J].高等學?；瘜W學報，2010，31（7）：1332-1336.

[2]戴偉娟，司端遠，辛勒，等.無花果多糖對小鼠細胞免疫功能的影響[J].中草藥，2000，31（5）：355-356.

[3]李明，安熙強，馬媛.無花果多糖研究進展[J].新疆中醫(yī)藥，2010，28（1）：79-80.

[4]陳霞.無花果多糖的提取及其對鯽魚非特異性免疫功能影響的研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2009.

[5]Yang Xiao-ming，Yu Wei，Zhong-pin Ou，et al.Antioxidant and immunity activity of water extract and crude polysaccharide from Ficus carica L.fruit[J].Plant Foods for Human Nutrition，2009，64：167-173.

[6]張秀麗，楊小明，何娟，等.無花果多糖的部分理化性質(zhì)研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（11）：35-38.

[7]ìlhami Gül?in，·I Güng?r S，at，S，ükrü Beydemir，et al.Comparison of antioxidant activity of clove（Eugenia Caryophylata Thunb）buds and lavender（Lavandula stoechas L.）[J].Food Chemistry，2004，87：393-400.

[8]蔡仲軍，陳仕江，馬開森，等.珠芽蓼清除羥自由基作用研究[J].中國藥物與臨床，2004，4（2）：96-98.

[9]谷學新，邰超.一個新的測定Fenton反應產(chǎn)生的·OH及清除的熒光方法[J].分析科學學報，2002，18（6）：460-463.

[10]黎金.蕎麥多肽制備及其抗氧化活性研究[D].楊陵：西北農(nóng)林科技大學，2009.

[11]Mathew S，Abraham T E.In vitro antioxidant activity and scavenging effects of Cinnamomum verum leaf extract assayed by different methodologies[J].Food Chemistry Toxicol，2006，44（2）：198-206.

[12]李海洋.滴定分析的數(shù)學研究[J].錦州師范學院學報：自然科學版，2001，22（4）：31-32.

[13]華允芬.鐵皮石解多糖成分研究[D].杭州：浙江大學，2005.

Study on purification and antioxidation of polysaccharides from Ficus carica

LI Wen-jie1，YANG Xiao-ming1，*，ZHANG He-nan1，LI Shi-chao1，F(xiàn)ANG Yang-yang2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

Objective：To purify the polysaccharides from Ficus carica L.fruit and investigate its antioxidant activity. Methods：Ficus carica polysaccharides（FCPS）was obtained by hot water extracting and ethanol precipitation，removing the protein by Sevage method.Then FCPS was purified by using cellulose DEAE-52.Physicochemical characteristic of polysaccharides was researched by UV and some other methods.HPGPC was used to study the purity and distribution range of relative molecular mass of polysaccharides.And the antioxidant activity of the polysaccharides was tested.Results：FCPS was a kind of mixed acidic polysaccharides which had no protein and nucleinic acid.The relative molecular mass was between 5.92×105and 2.0×106u.The three purified components FCPS1，F(xiàn)CPS2 and FCPS3 were obtained by DEAE-52 cellulose column Chromatography. After HPGPC analyses，F(xiàn)CPS2 showed a symmetrical peak and its molecular mass was 2.61×106u.As about antioxidation，scavenging superoxide anion radical（FCPS2：IC50=430滋g/mL，F(xiàn)CPS：IC50＝620滋g/mL）and scavenging hydroxyl radical（FCPS2：IC50=1000滋g/mL，F(xiàn)CPS：IC50＝4780滋g/mL）were also notedly improved，whereas，the reducing power was 0.055 and 0.133 respectively when their concentrations were 1000滋g/mL.Conclusions：The homogeneous polysaccharides FCPS2 which had been purified showed a better ability to remove superoxide anion and hydroxyl radicals，while its reducing power decreased.

Ficus carica polysaccharides；separation and purification；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0161-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.027

2013－11－06 *通訊聯(lián)系人

李文婕（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取與純化。