黃軍凱， 張國(guó)珍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

炭疽菌屬（Colletotrichu m）真菌寄主范圍廣泛，可以危害果樹、農(nóng)作物和花卉等［1－2］，引起多種植物的炭疽病。草莓炭疽病主要危害果實(shí)、根莖、葉片、匍匐莖、葉柄、花等，可導(dǎo)致果腐、根莖腐爛及整株萎蔫死亡、葉片、匍匐莖和葉柄的斑病及花枯［3］。以往報(bào)道，引起草莓炭疽病的病原菌主要有草莓炭疽菌（Colletotrichu m f r agariae）、膠 孢 炭 疽 菌 （C．gl oeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．a(chǎn)cutatu m）［3］。實(shí)際上，過(guò)去傳統(tǒng)意義上的膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌均為復(fù)合種，每一復(fù)合種內(nèi)包含有多個(gè)種［4］。本實(shí)驗(yàn)室利用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，對(duì)引起草莓炭疽病的病原菌進(jìn)行了種的鑒定，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)草莓炭疽病菌的優(yōu)勢(shì)種為Colletotrichum theobromicol a（原來(lái)稱為Colletotrichum f r agariae）（結(jié)果待發(fā)表）。

誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生分生孢子是植物病原學(xué)研究、植物抗病性鑒定等工作中的重要環(huán)節(jié)。常規(guī)誘導(dǎo)分生孢子產(chǎn)生的方法有菌絲涂斷、近紫外光照射、采用不同培養(yǎng)基或在培養(yǎng)基中添加植物組織、某種營(yíng)養(yǎng)成分等［5－7］。

近年來(lái)隨著草莓種植面積的擴(kuò)大和種植年限的增加以及某些感病品種的推廣，草莓炭疽病的發(fā)生在國(guó)內(nèi)日趨嚴(yán)重［8］，科研單位和育種部門正加快草莓抗炭疽病的品種選育。如何通過(guò)人工培養(yǎng)，快速、大量獲得炭疽病菌的分生孢子是獲得有效接種體的重要保證。我們?cè)谶M(jìn)行草莓炭疽病菌的研究中，發(fā)現(xiàn)有些炭疽菌的菌株在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢少或產(chǎn)孢比較慢。在篩選草莓炭疽病菌的生防菌的過(guò)程中，把濾掉細(xì)菌的LB培養(yǎng)液添加到PDA培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)對(duì)炭疽菌分生孢子的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。為此，我們通過(guò)試驗(yàn)分析了LB培養(yǎng)基的主要成分中，究竟是酵母提取物還是胰蛋白胨對(duì)炭疽菌的產(chǎn)孢有促進(jìn)作用，并確定了促進(jìn)產(chǎn)孢成分的最佳用量。同時(shí)，還測(cè)定了涂斷菌絲的方法是否對(duì)炭疽菌有促進(jìn)產(chǎn)孢的作用。試驗(yàn)結(jié)果可為快速獲得草莓炭疽病菌的大量分生孢子提供簡(jiǎn)便易行的方法和培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菌株分離自北京地區(qū)草莓炭疽病病樣的根莖，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定為C．theobromicol a，是草莓炭疽病菌中的優(yōu)勢(shì)種，所用菌株為C36。

1．2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨（T）10 g，酵母提取物（YE）5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，加水定容至1 L，用Na OH調(diào)節(jié)p H至7．4。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

PDA＋10%LB：1 L PDA培養(yǎng)基加入100 mL LB培養(yǎng)液。

PDA＋0．1%T：1 L PDA培養(yǎng)基加入1 g胰蛋白胨。

PDA＋0．05%YE、PDA＋0．1%YE和PDA＋0．5%YE：1 L PDA培養(yǎng)基分別加入0．5、1和5 g酵母提取物。

各培養(yǎng)基121℃滅菌20 min，備用。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 培養(yǎng)基對(duì)炭疽病菌生長(zhǎng)的影響

將炭疽病菌菌株C36在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿近邊緣時(shí)用打孔器（直徑4 mm）在菌落邊緣打取菌餅，分別接種到上述（1．2培養(yǎng)基）不同培養(yǎng)基平板（直徑6 c m）中央，28℃，14 h光照條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后測(cè)量菌落直徑，觀察并比較炭疽菌在不同培養(yǎng)基上的菌落特征和生長(zhǎng)速度。以PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。每處理重復(fù)3皿。

1．3．2 培養(yǎng)基對(duì)炭疽病菌產(chǎn)孢的影響

接菌方法和培養(yǎng)條件同1．3．1。培養(yǎng)5 d后，將整皿的分生孢子洗下，稀釋成合適的孢子濃度，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算單位菌落面積的產(chǎn)孢量。以PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。每處理重復(fù)3皿。

1．3．3 涂斷氣生菌絲對(duì)炭疽病菌分生孢子產(chǎn)生的影響

菌落生長(zhǎng)3 d后，用無(wú)菌棉簽將菌落上的氣生菌絲涂斷，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，洗下整皿的分生孢子，計(jì)數(shù)方法同1．3．2，以不涂斷的處理為對(duì)照。每處理重復(fù)3皿。

1．4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17．0軟件和Office Excel 2007軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 PDA中添加LB培養(yǎng)液及其主要成分對(duì)炭疽病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

在前期的其他試驗(yàn)中，我們偶然發(fā)現(xiàn)PDA培養(yǎng)基中添加一定量的LB培養(yǎng)液對(duì)草莓炭疽病菌有促進(jìn)產(chǎn)孢的作用，為了明確LB培養(yǎng)液以及其中的哪種主要成分能夠促進(jìn)產(chǎn)孢，試驗(yàn)分別設(shè)置PDA中添加10%LB培養(yǎng)液、0．1%胰蛋白胨和0．05%酵母提取物，測(cè)定不同培養(yǎng)基對(duì)炭疽病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響。

2．1．1 對(duì)菌落生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)的影響

PDA培養(yǎng)基中添加10%LB培養(yǎng)液對(duì)菌落生長(zhǎng)速度有一定影響，與對(duì)照相比菌落生長(zhǎng)有所減慢，添加0．1%胰蛋白胨和0．05%酵母提取物對(duì)菌落生長(zhǎng)速度均無(wú)顯著影響（表1）。但從菌落特征來(lái)看，添加LB和酵母提取物處理的菌落中央出現(xiàn)較明顯的肉粉色的產(chǎn)孢區(qū)（圖1b），添加胰蛋白胨的則不明顯，說(shuō)明添加LB培養(yǎng)液促進(jìn)產(chǎn)孢可能主要是酵母提取物的作用。

表1 PDA培養(yǎng)基中添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物對(duì)草莓炭疽病菌C36菌落生長(zhǎng)速度的影響（3 d）1）Table 1 Effects of LB，tryptone and yeast extract added in PDA media on colonial growth rate of C．theobromicola C36（3 d）

圖1 C．theobromicola C36在添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物的PDA培養(yǎng)基上的菌落特征（3 d）Fig．1 The colonies of C．theobromicola C36 on PDA media with LB，tr yptone and yeast extract，respectively（3 d）

2．1．2 對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在PDA培養(yǎng)基中分別添加10%LB培養(yǎng)液和0．05%酵母提取物，培養(yǎng)3 d的菌株產(chǎn)孢量分別為15．51×104個(gè)／c m2和17．67×104個(gè)／c m2（圖2），分別是對(duì)照產(chǎn)孢量的5．8倍和6．6倍。雖然添加胰蛋白胨的產(chǎn)孢量也高于對(duì)照，但明顯低于添加酵母提取物的處理。結(jié)果表明，PDA中添加LB培養(yǎng)液促進(jìn)炭疽病菌產(chǎn)孢，主要是酵母提取物的作用。

圖2 PDA培養(yǎng)基中添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物對(duì)C．theobromicola C36產(chǎn)孢量的影響（3 d）（P＜0．05）Fig．2 Effects of LB，tryptone and yeast extract added in PDA media on sporulation of C．theobro micol a C36（3 d）（P＜0．05）

2．2 酵母提取物添加量對(duì)炭疽病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

為了進(jìn)一步確定促進(jìn)分生孢子產(chǎn)生的酵母提取物的最適添加量，在上述添加0．05%酵母提取物的基礎(chǔ)上，又分別設(shè)置了0．1%和0．5% 兩個(gè)用量。

2．2．1 對(duì)菌落形態(tài)、菌落生長(zhǎng)速度的影響

在PDA培養(yǎng)基中分別添加0．05%、0．1%和0．5%酵母提取物的3個(gè)添加量中，隨著酵母提取物添加量的增加，菌落生長(zhǎng)速度有所減慢（表2），說(shuō)明酵母提取物的濃度超過(guò)0．05%對(duì)菌落生長(zhǎng)有一定抑制作用。隨酵母提取物濃度的增加，菌落顏色變白，添加量為0．1%時(shí)菌落中央的肉粉色產(chǎn)孢區(qū)更明顯，而添加量增加到0．5%時(shí)產(chǎn)孢區(qū)反而減?。▓D3）。因此，添加0．1%酵母提取物最有利于C．theobromicola的產(chǎn)孢。

表2 PDA培養(yǎng)基中酵母提取物添加量對(duì)C．theobromicola C36菌落生長(zhǎng)速度的影響（3 d）（P＜0．05）Table 2 Effects of the contents of yeast extract added in PDA media on colonial growth rate of C．theobromicola C36（3 d）（P＜0．05）

圖3 C．theobr omicola C36在添加不同量酵母提取物的PDA培養(yǎng)基上的菌落特征（3 d）Fig．3 Colonies of C．theobr omicola C36 on PDA media with different contents of yeast extr act（3 d）

2．2．2 對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在PDA培養(yǎng)基中分別添加0．05%、0．1%和0．5%酵母提取物的3個(gè)添加量中，以添加0．1%酵母提取物的產(chǎn)孢量最高，為42．41×104個(gè)／c m2（圖4），表明PDA培養(yǎng)基中添加0．1%酵母提取物最有利于C．theobromicol a的分生孢子產(chǎn)生。

圖4 PDA培養(yǎng)基中添加不同量的酵母提取物對(duì)C．theobr omicola C36產(chǎn)孢量的影響（3 d）（P＜0．05）Fig．4 Effects of different contents of yeast extract added in PDA media on spor ulation of C．theobr omicola

2．3 涂斷菌絲對(duì)C．theobromicola產(chǎn)孢量的影響

菌株C36在培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d時(shí)，用無(wú)菌棉簽將菌落表面的氣生菌絲全部擦掉，再繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，可見培養(yǎng)基表面氣生菌絲很少，布滿一層肉粉色分生孢子（圖5b1～b4），而在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d未涂斷菌絲的菌落氣生菌絲茂密，只在菌落中央?yún)^(qū)域有產(chǎn)孢（圖5a2～a4）。從圖5還可以看出，不論是涂斷還是未涂斷菌絲的處理，添加酵母提取物后均比對(duì)照PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢區(qū)明顯。

涂斷菌絲后，在添加不同量酵母提取物的培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量都較未涂斷菌絲的顯著提高。在添加0．1%酵母提取物的培養(yǎng)基上未涂斷菌絲的產(chǎn)孢量為57．91×104個(gè)／c m2，涂斷菌絲后產(chǎn)孢量達(dá)101．24×104個(gè)／c m2，為前者的1．75倍；在添加0．5%酵母提取物的培養(yǎng)基上未涂斷菌絲的產(chǎn)孢量為32．58×104個(gè)／c m2，涂斷菌絲后產(chǎn)孢量達(dá)143．90×104個(gè)／cm2，為前者的4倍（圖6）。試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步印證了所觀察到的肉粉色產(chǎn)孢區(qū)域大小和濃密與產(chǎn)孢多少直接相關(guān)，肉粉色區(qū)域越濃密，產(chǎn)孢量越大。由此可見，在PDA培養(yǎng)基中添加酵母提取物并結(jié)合菌絲涂斷處理可使產(chǎn)孢量大大提高。

圖5 未涂斷菌絲培養(yǎng)5 d（a）與涂斷菌絲2 d后（b）C．theobr omicola C36的菌落特征Fig．5 Colonies of C．theobr omicol a C36 gr owing 5 days with un－er ased aerial mycelia（a）and 2 days after the aerial mycelia erased（b）

未涂斷菌絲的處理中，對(duì)照?qǐng)D4和圖6中的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)炭疽菌的產(chǎn)孢量有所增加，添加不同量的酵母提取物對(duì)產(chǎn)孢的影響是一致的，均為添加0．1%酵母提取物的產(chǎn)孢量最高。涂斷菌絲的處理中，添加0．5%酵母提取物處理的產(chǎn)孢量最高，為143．90×104個(gè)／c m2，與未涂斷菌絲的處理不完全一致，有可能與培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)2 d或菌絲涂斷作用有關(guān)。

圖6 菌絲涂斷處理對(duì)C．theobromicol a C36產(chǎn)孢量的影響（5 d）（P＜0．05）Fig．6 Effects of erasing aerial mycelia on sporulation of C．theobromicola C36（5 d）（P＜0．05）

3 小結(jié)與討論

炭疽菌的人工培養(yǎng)通常采用PDA培養(yǎng)基，一般需要培養(yǎng)7 d左右才能產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量也較少。本試驗(yàn)中，在PDA中添加0．1%的酵母提取物即可在培養(yǎng)3 d時(shí)得到大量的分生孢子，如果再結(jié)合涂斷菌絲的方法繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，可使產(chǎn)孢量再提高2倍以上。本試驗(yàn)中誘發(fā)草莓炭疽病菌大量產(chǎn)孢的方法，將病原菌產(chǎn)孢對(duì)某種營(yíng)養(yǎng)成分的需求與涂斷菌絲刺激病原菌產(chǎn)孢兩種方式結(jié)合起來(lái)，與以往報(bào)道的其他方法［5－7］有所不同。該方法對(duì)于草莓上其他種的炭疽菌也是適用的（數(shù)據(jù)未列出）。

據(jù)我們近幾年對(duì)草莓病害的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在設(shè)施栽培草莓上，炭疽病的危害主要表現(xiàn)在定植期引起植株的枯萎死苗，造成嚴(yán)重缺苗和毀苗，損失嚴(yán)重。因此，加強(qiáng)對(duì)草莓炭疽病的抗病育種非常必要。而進(jìn)行抗病品種的選育需要人工培養(yǎng)炭疽菌，以分生孢子作為接種體［8］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)炭疽菌的產(chǎn)孢方法，培養(yǎng)3～5 d便可獲得大量的分生孢子作為接種體使用。本研究中所用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分簡(jiǎn)單，促進(jìn)產(chǎn)孢的操作簡(jiǎn)便，獲得的分生孢子新鮮，菌齡一致，且產(chǎn)孢量大，非常適合相關(guān)科研單位進(jìn)行抗病性鑒定時(shí)使用。

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