解曉露,陳 成,魏 東,李恪梅,付麗麗,黃長江,王國治,
(1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院,浙江溫州 325035;2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室,北京 100050)
布氏菌活疫苗皮內(nèi)與皮下接種的免疫效果評價
解曉露1,陳 成1,魏 東2,李恪梅2,付麗麗1,黃長江2,王國治1,2
(1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院,浙江溫州 325035;2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室,北京 100050)
將布氏減毒活疫苗通過皮內(nèi)注射和皮下注射方式免疫小鼠,比較2種方式的免疫效果。用布氏菌活疫苗,通過皮內(nèi)和皮下注射免疫小鼠,免疫4周后分離血清及脾臟淋巴細(xì)胞。E L I SA法檢測免疫動物血清中總Ig G抗體;E L I SP 0 T法檢測分泌I F N-γ、I L-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目,同時用E L I SA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌I F N-γ、I L-4的水平;用流式細(xì)胞儀對T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分類;用羊布魯氏菌弱毒株M 5攻擊免疫動物,通過脾臟細(xì)菌計(jì)數(shù)評價布氏活疫苗的免疫保護(hù)作用。E L I SA、E L I SP 0 T和T淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果顯示,2種免疫途徑均能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,但兩者間無顯著差異;B A L B/c小鼠攻毒試驗(yàn)顯示皮內(nèi)注射組脾臟中布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為0,皮下注射組為2.27±0.21,陰性對照組為5.13±0.16。由此可知,2種免疫方法均能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,但皮內(nèi)注射組的免疫保護(hù)作用顯著優(yōu)于皮下注射組,提示通過皮內(nèi)注射布氏疫苗可能是安全、高效的免疫途徑。
布氏疫苗;免疫途徑;體液免疫;細(xì)胞免疫;保護(hù)力
布魯菌屬(B r uc e l l a),又稱布魯斯菌屬,因最早由美國醫(yī)師D a v i d B r uc e首次分離而得名。布魯菌屬細(xì)菌是人畜共患傳染病的病原菌,有6個生物種,19個生物型,但經(jīng)DNA-DNA雜交研究證明本屬只有1個生物種,其他均為生物變種[1]。布魯氏菌具有侵襲力強(qiáng)、傳染途徑多、引起多器官損傷的特點(diǎn)。家畜感染后若得不到良好的治療可引發(fā)母畜流產(chǎn)和不育,人感染則主要引起波浪熱和轉(zhuǎn)化為慢性感染[2-3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國畜間布病流行情況大致經(jīng)歷了3個階段:20世紀(jì)50-70年代為高發(fā)期,部分省區(qū)疫情相當(dāng)嚴(yán)重,尤其是在牧區(qū),嚴(yán)重地區(qū)的人畜感染率達(dá)到60%~70%;80-90年代為基本控制期,由于增加了投入,布病疫情得到基本控制,布病陽性率大幅下降;2000年后為反彈期,布病疫情出現(xiàn)上升趨勢,家畜布病總的陽性率高達(dá)75%[4],每年造成近千萬元損失。
疫苗接種是防治布病最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段。目前,我國采用的人用布氏菌活疫苗[5]為牛種弱毒株104M菌株,接種方式為皮上劃痕。該方法操作復(fù)雜、不能定量接種,接種陽轉(zhuǎn)率低且保護(hù)效果有限,被接種者因劃痕產(chǎn)生疼痛不易被接受,從而影響疫苗的廣泛使用。鑒于布病疫情控制的需要,本研究采用皮下和皮內(nèi)2種注射方式免疫小鼠,從體液免疫、細(xì)胞免疫和保護(hù)力試驗(yàn)3個方面的結(jié)果全面評價不同免疫途徑的免疫效果。
1.1 材料
SP F級B A L B/C小鼠30只,6~8周,白色雌性,中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)試驗(yàn)動物中心提供(試驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SC X K(京)2009-0017),飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。
皮內(nèi)和皮下注射用布氏活疫苗和羊布氏菌M 5弱毒株均由中檢院結(jié)核病疫苗室保存。
B r-P P D蛋白由中檢院結(jié)核病疫苗室提供,制備方法見參考文獻(xiàn)[6]。
儀器試劑有生物安全柜(telstar bio-Ⅱ-A)、酶標(biāo)儀(Labsys tmsDragon-MK 3)、恒溫培養(yǎng)箱(天
津市泰斯特儀器-D H 6000A B型)、高速離心機(jī)(德國eppendorf-5415D)、Immuno Spot Analy zer(CTLImm unSpot)、C 02培養(yǎng)箱(Napco Scientific company)和ELISP0T斑點(diǎn)讀數(shù)儀(Cellμ L a r T e c hno l og yL t d.)。
布氏菌培養(yǎng)基(腦心瓊脂購自美國B D公司),牛血清白蛋白(B SA)和C o nA(美國Sig m a公司),E L I SP 0 T試劑盒(Mo us e I F N-γ及I L-4 E L I Spo t K i t)購自美國B D公司,達(dá)優(yōu)-淋巴細(xì)胞分離液、無血清培養(yǎng)基、I F N-γ及I L-4 E L I SA預(yù)包被試劑盒均購自深圳達(dá)科為公司,堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠Ig G(美國B e t hy l公司),pN P P底物顯色液(Sur Mo di c s)。
1.2 方法
1.2.1 分組及免疫
將30只6~8周齡SP F級B A L B/C小鼠隨機(jī)分成3組,每組10只。第1組為皮內(nèi)注射組(5 x 107個·只-1),第2組為皮下注射組(5 x 107個·只-1),第3組為陰性對照組(生理鹽水)。免疫4周后,摘眼球取血,4℃放置4 h后分離血清(3 000 r·m i n-1,20 min),-20℃保存。
1.2.2 抗體水平檢測
用間接E L I SA法檢測小鼠血清中Ig G的效價。以B r-P P D蛋白4μg·m L-1的濃度包被96孔酶標(biāo)板,4℃過夜;T B S-T300μL洗板5次,用1%的B SA封閉(200μL·孔-1),37℃靜置2 h;每孔加入100μL的20倍開始倍比稀釋的待檢血清,37℃靜置2 h;按1∶2 500稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記抗小鼠Ig G,洗板后每孔加入100μL,37℃靜置1 h;洗板,每孔加入100 μL的pN P P底物顯色液,室溫避光60 min后,在波長為405 nm處檢測吸光值。
1.2.3 細(xì)胞免疫檢測
分泌I F N-γ、I L-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目檢測。免疫4周后,分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔添加混有2.0 x 106個·m L-1濃度細(xì)胞100 μL,分別加入100μL布氏P P D抗原和布氏B p26抗原(終濃度均為10μg·m L-1)2種抗原刺激。每種抗原刺激物做復(fù)孔,另用細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對照,1孔加C o nA作陽性對照(終濃度為5μg·m L-1)。共同孵育22 h后,按E L I SP 0 T操作,依次加入檢測抗體等試劑,洗板,顯色,計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。
體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子產(chǎn)生水平檢測。取48孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔中加2.0 x 106個· m L-1濃度細(xì)胞400μL,每孔分別加入50μL布氏P P D抗原和布氏B p26抗原(終濃度為10μg· m L-1)2種抗原刺激。分別以C o nA(終濃度為5 μg·m L-1)和培養(yǎng)基為陽性和陰性對照。37℃, 5%C 02培養(yǎng)箱中孵育22 h,孵育完畢后,對培養(yǎng)物進(jìn)行離心,取各孔細(xì)胞培養(yǎng)液上清,用小鼠I F N-γ、I L-4 E L I SA試劑盒檢測體外不同刺激物刺激小鼠脾細(xì)胞分泌I F N-γ、I L-4的情況。
1.2.4 T淋巴細(xì)胞亞群分類
將1.2.3中分離的脾臟細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0 x 107個·m L-1,每孔分別加入10μL的刺激物和200μL的細(xì)胞,刺激物為布氏P P D抗原和布氏B p26抗原(終濃度為10μg·m L-1)2種抗原,分別用P MA/離子霉素和培養(yǎng)基為陽性和陰性對照,共同孵育3 h后,每孔加入10μL的阻斷劑。12 h后進(jìn)行胞外C D 3和C D 4及胞內(nèi)I F N-γ、I L-4的染色,流式細(xì)胞儀測定,C e l l que s t軟件分析。
1.2.5 布魯氏菌活疫苗免疫保護(hù)力檢測
對每組剩余的5只動物皮下攻擊羊種布氏菌M 5弱毒株,攻擊劑量為5 x 108個·只-1,攻擊部位為后肢皮下。4周后斷頸處死動物,無菌取脾臟,通過每個脾臟細(xì)菌計(jì)數(shù)比較布魯氏菌活苗2種免疫方式的保護(hù)效果。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉX±S表示,各組免疫動物的抗體和細(xì)胞因子效價取以10為底的對數(shù)后進(jìn)行t檢驗(yàn);用G r a phP a d P r i s m 6繪圖及SP SS統(tǒng)計(jì)軟件分析。結(jié)果以P<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 血清中總IgG水平
圖1顯示,陰性小鼠組檢測不到特異性抗體,皮內(nèi)注射組和皮下注射組均能產(chǎn)生高滴度抗體, Ig G效價分別為642.23和640.00,分析表明,兩者間差異不顯著(t=0.006,n=10)。
圖1 血清Ig G抗體效價
2.2 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(E L I S OP T)
2.2.1 P P D和B p26抗原刺激后分泌I F N-γ的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目
將已形成斑點(diǎn)的96孔板終止反應(yīng),自然風(fēng)干過夜后上計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并拍照,對每孔內(nèi)的斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)控。最終斑點(diǎn)計(jì)數(shù)顯示(圖2),皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下分泌的I F N-γ的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯高于陰性對照組,差異顯著;但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=3.069,n=10),在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比,差異顯著(t= -2.914,n=10)。
圖2 不同刺激物對淋巴細(xì)胞分泌I F N-γ斑點(diǎn)數(shù)的影響
2.2.2 P P D和B p26抗原刺激后分泌I L-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目
將已形成斑點(diǎn)的96孔板終止反應(yīng),自然風(fēng)干過夜后上計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并拍照,對每孔內(nèi)的斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)控。最終斑點(diǎn)計(jì)數(shù)顯示(圖3),皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下分泌的I L-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯高于陰性對照組,差異顯著;但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=1.986,n=10),在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t= 1.752,n=10)。
2.3 體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子
利用E L I SA方法檢測以P P D抗原和B p26抗原體外刺激小鼠脾細(xì)胞分泌I F N-γ、I L-4水平。圖4顯示,在P P D和B p26抗原刺激下,分泌I F N-γ的含量明顯高于陰性組,差異顯著;但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=1.714,n=10),在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=-1.878,n=10)。I L-4含量很低,超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測限,結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖3 不同刺激物對淋巴細(xì)胞分泌I L-4斑點(diǎn)數(shù)的影響
圖4 不同刺激物體對小鼠脾細(xì)胞分泌I F N-γ含量的影響
2.4 T細(xì)胞亞群分類
2.4.1 P P D和B p26抗原刺激后C D 4+I F N-γ淋巴細(xì)胞比例
圖5顯示,由流式細(xì)胞分析儀分析后得到,皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下小鼠的C D 4+I F N-γ細(xì)胞比例均高于陰性組,差異顯著;但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=0.429,n=10),在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=-0.555,n=10)。
2.4.2 P P D和B p26抗原刺激后C D 4+I L-4淋巴細(xì)胞比例
圖6顯示,由流式細(xì)胞分析儀分析后得到,皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下,小鼠的C D 4+I L-4細(xì)胞比例均高于陰性組,差異顯著;但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=-0.429,n=10),在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著(t=0.2.372,n=10)。
2.5 布魯氏菌活苗免疫保護(hù)性
為比較2種免疫方式的免疫保護(hù)力,用羊布氏
菌M 5弱毒株皮下攻擊,以脾臟布氏菌載量為指標(biāo),評價免疫保護(hù)力。表1顯示,皮內(nèi)注射組脾組織含菌數(shù)對數(shù)值的平均數(shù)為0,皮下注射組為2.27 ±0.21,陰性對照組為5.13±0.16。
圖5 不同刺激物刺激小鼠C D 4+I F N-γ淋巴細(xì)胞比例
圖6 不同刺激物刺激小鼠C D 4+I L-4淋巴細(xì)胞比例
表1 2種方法免疫豚鼠在羊M 5攻擊感染后脾臟細(xì)胞中的細(xì)菌載量
目前,接種疫苗是世界公認(rèn)的能夠降低布病發(fā)生和傳播的最有效和最經(jīng)濟(jì)的方法。我國采用的是牛種弱毒株104M菌株制成的減毒活疫苗,一般只需接種1次,劑量較小,副反應(yīng)輕微或無,且免疫效果優(yōu)于滅活疫苗,免疫較持久,能同時產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫,是應(yīng)用最廣泛的疫苗形式之一。但該疫苗的接種方式為皮上劃痕,不僅接種復(fù)雜,不能定量,還經(jīng)常伴有局部或異常反應(yīng),使被接種者皮膚有損傷且劃痕時疼痛,同時會遺留疤痕,因此改善布氏疫苗的免疫途徑成為研究的熱點(diǎn),國內(nèi)外均有學(xué)者正在對布氏疫苗的免疫方法進(jìn)行深入的研究和探索[7-8]。
本試驗(yàn)用E L I SA法檢測免疫動物血清中總Ig G抗體的含量,結(jié)果顯示,皮內(nèi)組和皮下組Ig G抗體效價分別為642.23和640.00,說明抗體效價并不高,這與試驗(yàn)預(yù)期是相符合的,因?yàn)椴际暇且环N胞內(nèi)寄生菌,對其清除起關(guān)鍵作用的是細(xì)胞免疫,而體液免疫僅起輔助作用。同時,用E L I SP 0 T法檢測分泌I F N-γ、I L-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目時發(fā)現(xiàn),分泌I F N-γ的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)高于分泌I L-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù);用E L I SA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況時發(fā)現(xiàn),I F N-γ的分泌水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于I L-4;這說明T h1細(xì)胞是參與細(xì)胞免疫的主要免疫細(xì)胞,這與減毒活疫苗的作用機(jī)理相符[9-10]。
疫苗的效力測定試驗(yàn)是評價疫苗免疫保護(hù)性最可靠指標(biāo)。傳統(tǒng)對布氏疫苗的研究主要是使用豚鼠,效力試驗(yàn)用強(qiáng)毒株攻擊,本研究參照中國藥典效力測定的方法[11],以小鼠為動物模型,羊布氏菌M 5弱毒株攻擊,大大提高了試驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性和安全性。結(jié)果顯示,皮內(nèi)注射組脾臟中布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為0,皮下注射組為2.27±0.21,該數(shù)據(jù)說明皮內(nèi)注射可大大增強(qiáng)機(jī)體對抗布氏菌的保護(hù)力,提示通過皮內(nèi)注射布氏疫苗可能是安全、高效的免疫途徑,為研究布氏菌活疫苗接種途徑奠定基礎(chǔ)。
雖然皮下和皮內(nèi)2種免疫途徑均能誘導(dǎo)顯著高于對照組的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,但兩者在誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度上并無顯著差異,而在保護(hù)力試驗(yàn)中,皮內(nèi)注射組卻顯著優(yōu)于皮下注射組,這說明保護(hù)力的高低和免疫應(yīng)答的強(qiáng)度之間并無明顯正相關(guān)聯(lián)系,本課題組會就該課題繼續(xù)進(jìn)行深入研究。
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(責(zé)任編輯:張瑞麟)
S 829.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:0528-9017(2014)05-0767-04
2014-03-17
重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)(2014Z X 09304311-002)
解曉露(1989-),女,安徽合肥人,碩士生,研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)。E-mail:x i a o l ux i e 126@126.com。
王國治。E-mail:t bt e s t l a b@v i p.t o m.com。
黃長江。E-mail:c j hua ng 5711@163.com。
文獻(xiàn)著錄格式:解曉露,陳成,魏東,等.布氏菌活疫苗皮內(nèi)與皮下接種的免疫效果評價[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(5):767-770,779.