崔海輝
(浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310018)
蜜蜂消化道內(nèi)含物細菌群落組成的PCR-DGGE分析
崔海輝
(浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310018)
通過PCR-DGGE技術(shù)研究蜜蜂消化道內(nèi)含物的細菌群落組成,結(jié)合蜜蜂消化道細菌的形態(tài)特征,對蜜蜂腸道可培養(yǎng)的細菌進行分類與鑒定,研究分析了春季和夏季2個季節(jié)健康的蜜蜂工蜂的腸道菌相區(qū)別,同時還比對了春季健康蜜蜂和病蜂腸道菌相的區(qū)別。
蜜蜂;消化道;PCR-DGGE;分析
蜜蜂屬于昆蟲綱膜翅目細腰亞目針尾部蜜蜂總科蜜蜂科(A pi da e)蜜蜂亞科(A pi na e)蜜蜂屬(A p i s),是以雌性個體為主的社會性群體生活昆蟲,分布于除南北極以外的世界各地[1]。
蜜蜂體內(nèi)存在的微生物菌相與蜜蜂的營養(yǎng)生理活動有著密切的聯(lián)系,兩者相互依存、互相作用而不可分割,微生物對寄主腸道的消化、吸收、營養(yǎng)、免疫、生物拮抗等很多方面起著重要作用[2-4]。因此微生物的分布及種類直接影響到蜜蜂的健康。中國作為養(yǎng)蜂大國,但國內(nèi)對健康蜜蜂及病蜂腸道的菌相分析極為少見。因此,開展蜜蜂微生物生態(tài)的研究對蜜蜂的養(yǎng)殖、保健和蜂產(chǎn)業(yè)的深度開發(fā)都有重要意義。
由于自然界中85%~99%的細菌是不可分離培養(yǎng)的[5],因此通過分離純化培養(yǎng)來鑒定腸道微生物種類,難以真實反映蜜蜂消化道細菌群落組成的實際情況。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,直接抽提樣品中總DNA,通過擴增16S r R N A片段和D G G E指紋圖譜分離[5-6],可以更加全面地分析微生物群落組成,目前已成為國內(nèi)外微生物分子生態(tài)學(xué)研究的常用方法。
本文采用16S r R N A基因克隆文庫法,分析冬季和春季健康的蜜蜂工蜂的腸道菌相區(qū)別,同時還比對了春季健康蜜蜂和病蜂腸道菌相的區(qū)別,為開展蜜蜂腸道微生態(tài)研究提供基礎(chǔ)性參考資料,也為今后蜜蜂疾病的生物防治提供理論基礎(chǔ)。
1.1 樣品采集
健康活體的蜜蜂工蜂成蟲和患爬蜂病的蜜蜂采自浙江蕭山市各大養(yǎng)蜂的農(nóng)場。樣品采集時間為春季和冬季,春季時同時采集患有爬蜂病的病體。每次采樣時,每個蜂場的取樣量為200只左右蜜蜂,采樣及運送過程中盡量保持其活力,送至實驗室后,立刻取組織進行增菌培養(yǎng)。
1.2 樣品總DNA提取
采用B i o s pi n細菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品中的微生物基因組DNA,提取方法按試劑盒說明書執(zhí)行,具體操作步驟如下。
收集細菌,取0.5~4.0 m L細菌于最大速度離心1 min,吸棄上清。加入100μLE LBuffer,使用tip頭吹打均勻。37℃溫育40 min,對部分革蘭氏陽性細菌,可將溫育時間延長至1 h。加入100μL R S B uf f e r,隨后加入PK Solution,充分混勻。于56℃環(huán)境中溫育15 min,對于難裂解樣品可將溫育時間延長至30 min。加200μLG AB uf f e r混合均勻,12 000g離心5~10 min。將上清液移至新的1.5 m L離心管,加入400μLB A Buffer,混合均勻。將混合液體轉(zhuǎn)移至Spincolumn,10 000g離心1 min,棄去接液管中液體。向Spin column中加入500μLGB indingB uffer,10000g離心30s,棄接液管中液體。向Spincolumn中加入500μLWash Buffer,10 000g離心30 s,棄接液管中液體。重復(fù)該操作1次。再次將Spincolumn于10 000g離
心1 min,并將Spincolumn轉(zhuǎn)移至新的1.5 m L離心管。向Spincolumn中加入50μLE l ut i o n B uf f e r,室溫溫育1 min,于12 000g離心1 min,棄去Spincolumn,1.5 m L離心管中液體含有DNA。細菌16S r DNAV 3區(qū)P C R擴增。
1.3 P C R反應(yīng)條件
94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,35個循環(huán),72℃延伸10 min,15℃保溫[7-9]。按照表1所列,在P C R管內(nèi)加入各種試劑后在P C R儀上進行反應(yīng)。
表1 P C R擴增體系參數(shù)
1.4 DGGE凝膠電泳
1.4.1 丙烯酰胺變性膠配置
采用35%和55%變性膠溶液進行D G G E電泳,具體配置方法如表2,蒸餾水均加至100 m L。
表2 不同濃度變性膠溶液配置
1.4.2 變性梯度凝膠電泳
變性梯度凝膠電泳制膠板的裝配參考儀器說明書進行。制膠和上樣的具體步驟如下。
取35%和55%變性膠溶液各15 m L,置于2個離心管中,每管加入15μLT E ME D,100μL 10%A P S,迅速混勻,用連有聚乙烯管分別吸取高濃度和低濃度膠溶液。
分別將含有高濃度、低濃度膠溶液的注射器放在梯度傳送系統(tǒng)的正確位置并固定好,再將注射器的聚丙烯管用三通管相連。
輕柔并勻速地旋轉(zhuǎn)凸輪來傳送溶液,帶膠灌滿后,小心插入梳子,讓凝膠聚合大約1 h。在凝膠聚合過程中,將7 L1 xT A E緩沖液加入電泳槽中,預(yù)熱到60℃。
凝膠完畢后拔走梳子,將膠放入到電泳槽內(nèi),清洗點樣孔。
將DNA樣品和6 xLoadingB uf f e r以5∶1比例混合,開始上樣,上樣量為10~20μL。
待電泳溶液溫度達到60℃時,開始電泳。在30 V電壓條件下,電泳30 min;然后將電壓調(diào)制150 V條件下,電泳4.5 h。
電泳完畢后用E B染色,然后用Q ua nt i t y0 ne(B i o-R a d)拍照。
1.5 DGGE條帶的切割、克隆與測序
對D G G E膠片上的主要條帶進行割膠回收DNA,經(jīng)第2次P C R擴增后,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,然后對所有條帶的P C R產(chǎn)物測序(由上海生物工程公司代測)。
2.1 16Sr DNAV 3區(qū)特征片段DGGE指紋圖譜
對D G G E膠片上的主要條帶進行割膠回收DNA(條帶1-52),經(jīng)第2次P C R擴增后,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,然后對所有條帶的P C R產(chǎn)物進行測序。由于31個條帶在割膠回收后,經(jīng)P C R擴增后濃度太低,無法測序,所以沒有得到這31個條帶的序列。圖1中D G G E圖譜條帶的數(shù)量可反映樣品的細菌多樣性,條帶信號的強弱可反映細菌的相對數(shù)量。
圖1 蜜蜂消化道內(nèi)含物中細菌群落的D G G E圖譜
2.2 春夏季健康蜜蜂腸道中細菌群落組成
在春季,健康蜜蜂腸道的主要有乳酸桿菌屬、熒光假單胞菌、梭狀芽孢桿菌屬、γ-變形桿菌屬、腸桿菌屬;在夏季健康蜜蜂腸道的主要有乳酸桿菌屬、熒光假單胞菌、梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、明串珠球菌屬、沙雷氏菌屬、隆德假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬。
2.3 健康蜜蜂與患爬蜂病、白堊病蜂腸道中細菌種類組成
結(jié)合D G G E圖譜可知,患有爬蜂病的病蜂腸道中細菌有乳酸桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、γ-變形桿菌屬、腸桿菌屬、惡臭假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、大亞灣細菌、明串珠球菌屬,而患有白堊病病蜂腸道中細菌有乳酸桿菌屬、熒光假單胞菌、明串珠球菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬。
通過將測序所得的16S r DNA的V 3區(qū)序列與N C B I數(shù)據(jù)庫中已知的序列進行相似性比較發(fā)現(xiàn),蜜蜂腸道內(nèi)含物主要有乳酸桿菌屬、明串珠球菌屬、惡臭假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、大亞灣細菌、梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、熒光假單胞菌、瘤胃細菌屬、γ-變形桿菌屬、隆德假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬。該結(jié)論與從蜜蜂腸道分離培養(yǎng)并通過生理生化鑒定所得到的結(jié)果基本一致[7-9]。
從春季與夏季的健康蜜蜂腸道中細菌群落組成來看,在夏季蜜蜂腸道的細菌種類比春季有所增加,這說明在春夏不同季節(jié)的蜜蜂對腸道內(nèi)細菌群落產(chǎn)生了影響。蜜蜂腸道內(nèi)細菌菌群結(jié)構(gòu)差異明顯。
通過16S r DNA片段的D G G E圖譜發(fā)現(xiàn),健康蜜蜂腸道中細菌菌落多樣性高于患爬蜂病、白堊病病蜂腸道中細菌多樣性。
本研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂腸道內(nèi)細菌對蜜蜂個體和群體的健康都有重要意義,蜜蜂腸道細菌生物學(xué)功能多樣,具有很強的實用性。通過研究,為調(diào)節(jié)和改善蜜蜂腸道微生態(tài)環(huán)境構(gòu)建蜜蜂腸道細菌種質(zhì)資源庫和揭示蜜蜂腸道微生物的種類、作用及進一步探討其對蜜蜂成蟲的生命活動影響奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。
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(責(zé)任編輯:張瑞麟)
S 89文獻標志碼:A文章編號:0528-9017(2014)05-0759-02
2014-01-04
杭州市種子種苗項目(20120332H 09)
崔海輝(1979-),男,副教授,本科,研究方向為食品生物技術(shù),E-mail:c ui ha i hui@s i na.com。
文獻著錄格式:崔海輝.蜜蜂消化道內(nèi)含物細菌群落組成的PCR-DGGE分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(5):759-760,764.