李 麗，徐建國，羅君琴，柯甫志，聶振朋，徐昌杰

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310058；2.浙江省柑橘研究所,浙江黃巖 318020）

紅玉柑微芽嫁接技術(shù)試驗

李 麗1，2，徐建國2，羅君琴2，柯甫志2，聶振朋2，徐昌杰1

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310058；2.浙江省柑橘研究所,浙江黃巖 318020）

研究了莖尖大小、莖尖來源對紅玉柑莖尖微芽嫁接成活率的影響。試驗表明,以枳橙為砧木,微芽嫁接莖尖大小以含3～4個葉原基其莖尖微芽嫁接成活率較高。以成年態(tài)莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽作為接穗進行莖尖微芽嫁接,嫁接成活率較高,且成年態(tài)莖段試管誘導(dǎo)不定芽作為微芽嫁接接穗,解決了微芽嫁接受季節(jié)限制的問題。

雜柑；微芽嫁接；成年態(tài)莖段

隨著國內(nèi)外柑橘果品市場競爭的激化,各國都把選育高品質(zhì)雜柑新品種作為增強競爭力的一種手段,因而優(yōu)良性狀的雜柑也被視為21世紀(jì)的主推品種,推廣應(yīng)用無毒苗亦是21世紀(jì)柑橘業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要生產(chǎn)環(huán)節(jié),而柑橘莖尖微芽嫁接仍是獲得無病毒苗木最有效的方法［1-5］。紅玉柑是浙江省柑橘研究所以黃巖少核本地早為母本,劉本橙為父本人工雜交育成,是我國第1批柑橙優(yōu)良雜種。本雜種具有豐產(chǎn)、耐貯藏的良好性狀,生長勢也特別強盛,尤其適合在貧瘠的山地栽培。紅玉柑果大均勻,果皮橙黃色,鮮艷、光滑、果絡(luò)少而松,汁液較多,風(fēng)味濃郁,是一個有推廣前景的優(yōu)良雜柑品種。本試驗旨在通過紅玉柑微芽嫁接脫除黃龍病技術(shù)研究,以期為浙江地方特色柑橘的莖尖微芽嫁接脫毒成苗技術(shù)體系提供一定的技術(shù)依據(jù),為浙江地方特色柑橘的生物技術(shù)研究創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅玉柑、砧木種子和微芽嫁接接穗取自浙江省柑橘所試驗基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 砧木苗的培養(yǎng)

枳橙為砧木。于秋季（9月）采摘卡里佐枳橙成熟果實用75%酒精擦洗作表面消毒,用保鮮袋裝好,于4～5℃冷藏柜中貯藏備用。

從成熟的枳橙果實中剝?nèi)★枬M的種子,用1 m o l·L-1的N a 0 H溶液浸泡10～15 min,軟化種子表面的果膠,用清水沖洗直到果膠去除干凈。在無菌條件下,用5%的N a C I 0溶液（V/V）對種子消毒10 min。用無菌水沖洗4～5次。在滅菌濾紙上剝除種子的內(nèi)外種皮,接種于固體培養(yǎng)基（MT +糖30g·L-1）中,每試管接2～3粒種子。標(biāo)注品種和日期,置（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)14 d左右獲得黃化苗,嫁接前1～2 d置自然光下鍛煉,作為嫁接砧木［1］。

1.2.2 成年態(tài)莖段的離休培養(yǎng)

晴天午后取未自剪、半木質(zhì)化的紅玉柑夏秋新梢,剪去1.5～2.0cm莖段為外植體,自來水沖冼0.5 h,洗滌劑清洗3～5 min,70%酒精浸泡30 s,無菌水沖洗數(shù)次,10%N a C l 0溶液消毒10 min,無菌水沖洗3～5次,接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（M T+B A 0.5 mg·L-1+I A A0.05 mg·L-1+G A30.5 mg·L-1）上,2～3周后,誘導(dǎo)莖段腋芽再生,建立試管內(nèi)成年態(tài)莖段腋芽再生體系［3-4］。

1.2.3 接穗準(zhǔn)備

7-8月夏、秋嫩梢抽發(fā)初期［5-6］,晴天午后2：00左右,取田間2.0～2.5cm長的未自剪的紅玉柑嫩梢,裝入潔凈保鮮袋帶回室內(nèi)。先用自來水沖掉外植體表面的灰塵,再用洗潔精浸泡2 min,

用自來水沖洗干凈,于超凈工作臺上切取1.0～1.5cm長莖尖外植物體,置于已滅菌錐形瓶中,用5%（V/V）N a C l 0溶液消毒5～10 min,無菌水沖洗3～5次后待用。

1.2.4 莖尖微芽嫁接

無菌條件下,選擇莖較粗壯的13～14 d齡的黃化砧木苗,切去頂端和部分根端,留莖長2～3cm,留根長4cm,然后在砧木根頸上端1.5～2cm韌皮部開小三角形創(chuàng)口。在高倍體視顯微鏡下用嫁接刀尖剝?nèi)”Ａ羯L錐及1,2,3及4個葉原基的莖尖,嫁接到準(zhǔn)備好的砧木上,用刀背按壓使莖尖與砧木的橫切口完全接合。嫁接好的試管苗置入濾紙橋支撐的MT+糖30g·L-1基本液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度保持在（25±1）℃,光照為2 000 l x,每天12～14 h。試驗重復(fù)3次,接種后2～3周觀察記錄紅玉柑微芽嫁接苗成活率及萌芽率。

1.2.5 嫁接苗移栽

待嫁接苗長出4～5片葉后便可進行移栽。將待移栽的嫁接苗在自然光下煉苗1周。在移栽前準(zhǔn)備好培養(yǎng)土,成分為1/3珍珠巖+1/3蛭石+1/3泥炭,配好后高壓滅菌。將經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)土分裝在培養(yǎng)缽中。將嫁接苗從試管中取出,洗凈根部的培養(yǎng)液,移栽入培養(yǎng)缽中。把試管中殘留的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)缽,用清水澆灌,直到底部有水滴出。培養(yǎng)缽上罩以塑料袋,保持水分。移栽后3～8 d澆水1次。2周左右待嫁接苗生長穩(wěn)定后,將上面的塑料袋去除。60～90 d后,苗木長大,移栽到大的培養(yǎng)缽中繼續(xù)生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖大小對微芽嫁接成活率的影響

表1顯示,莖尖大小對莖尖微芽嫁接的成活率有明顯影響。當(dāng)莖尖含1～2個葉原基時,莖尖較易失水枯死,成活率最低,分別為0和16.7%；當(dāng)莖尖含3個葉原基時,嫁接成活率為53.3%；莖尖含4個葉原基時,嫁接成活率最高,為73.3%；莖尖含5個及以上葉原基時,莖尖切面與砧木切面不能完全粘合,且嫁接切口愈合效果差,嫁接1周內(nèi)即可發(fā)現(xiàn)莖尖褐變枯死,成活率和萌芽率均不理想。

嫁接4～6周后,各處理成活的嫁接苗每株取2～3片葉送本所檢測中心檢測黃龍病脫毒情況, P C R檢測結(jié)果顯示均不含黃龍病病原。

表1 不同莖尖大小微芽接成活率及萌芽率

2.2 不同來源莖尖對嫁接成活率的影響

由表2可知,試管嫩芽作為嫁接接穗,其嫁接成活率顯著優(yōu)于田間嫩芽作為接穗的嫁接成活率,二者的嫁接成活率分別為78.5%和55.2%,二者間存在顯著差異。

表2 不同來源莖尖對嫁接成活率的影響

2.3 嫁接苗移栽

莖尖微芽嫁接成活的試管苗長到2,3片真葉時轉(zhuǎn)管培養(yǎng)以加快生長,嫁接苗木長出4～5片真葉時便可移栽,7～8周統(tǒng)計移栽情況,發(fā)現(xiàn)無論是來自田間的莖尖嫁接成活的嫁接苗還是來自莖段不定芽的莖尖嫁接成活的嫁接苗,其移栽成活率都較高,均達85%以上。

3 小結(jié)

紅玉柑以卡里佐枳橙為砧木進行微芽嫁接,莖尖大小以3～4個葉原基為宜,過大過小均不利于嫁接成活。

目前文獻記載的柑橘莖尖微芽嫁接接穗均采自田間自然生長的新生枝芽,接穗受季節(jié)限制的問題較嚴(yán)重。本試驗以成年態(tài)紅玉柑莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽作為嫁接接穗進行微芽嫁接其成活率達78.5%,顯著高于以田間的紅玉柑夏秋梢作為嫁接接穗進行微芽嫁接的成活率55.2%。試驗表明,通過莖段離體誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽可一年四季提供嫁接接穗,解決了常規(guī)莖尖微芽嫁接接穗受季節(jié)限制的問題,同時提高了嫁接成活率。

本試驗微芽嫁接成活的嫁接苗均未檢測出黃龍病病原。送檢通過的嫁接苗在溫室大棚中的移栽成活率可達85%以上。

［1］ 陳澤雄,劉奕清,婁娟.利用柑橘莖段誘導(dǎo)不定芽改進微芽嫁接技術(shù)的研究［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2007,32（1）：57-61.

［2］ 姜玲,陳澤雄,徐象華,等.甌柑微芽嫁接脫毒及試管苗的快速培育技術(shù)［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,26（2）：233-236.

［3］ 羅君琴,李麗,聶振朋.柑橘試管內(nèi)莖尖微芽嫁接技術(shù)試驗初報［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2011（5）：1031-1032.

［4］ 王子成,李忠愛,鄧秀新.柑橘成年態(tài)莖段外植體消毒方法研究［J］.河南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2005,35（2）：57-60.

［5］ 劉文龍,李進進,陳升云,等.柑橘試管內(nèi)微芽嫁接方法探討［J］.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2009（3）：14-16,20.

［6］ 羅君琴,李麗,徐建國,等.本地早橘試管微芽嫁接初步試驗［J］.中國南方果樹,2011,40（4）：37-39.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 666文獻標(biāo)志碼：B文章編號：0528-9017（2014）05-0676-02

2013-12-18

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑橘）產(chǎn)業(yè)體系專項經(jīng)費資助（MA T S-N Y C Y T X-07）

李 麗（1976-）,女,浙江黃巖人,助理研究員,農(nóng)業(yè)推廣碩士生,從事園藝植物組織培養(yǎng)及生物育種工作。E-mail：hy l e e l y@163.com。

徐建國。

文獻著錄格式：李麗,徐建國,羅君琴,等.紅玉柑微芽嫁接技術(shù)試驗［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（5）：676-678.