魯忠富，王 莎，吳曉花，胡耀文，汪寶根，吳新義，徐 沛，李國(guó)景

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

利用插入/缺失標(biāo)記分析我國(guó)瓠瓜資源遺傳多樣性

魯忠富，王 莎，吳曉花，胡耀文，汪寶根，吳新義，徐 沛，李國(guó)景

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

瓠瓜作為重要的葫蘆科作物之一,在我國(guó)已有悠久的栽培歷史。瓠瓜分子標(biāo)記研究大大落后于黃瓜、白菜等作物,應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)開展瓠瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究,對(duì)促進(jìn)瓠瓜重要種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有重要意義。本研究選擇96份具有廣泛代表性的我國(guó)瓠瓜種質(zhì)材料,利用插入/缺失分子標(biāo)記技術(shù),研究分析了其遺傳多樣性和親緣關(guān)系,探討我國(guó)瓠瓜品種間的基因差異和瓠瓜亞種間及亞種內(nèi)的親緣關(guān)系。結(jié)果表明,瓠瓜種質(zhì)遺傳相似系數(shù)0.30～1.00,在遺傳相似系數(shù)0.68處可將96份瓠瓜種質(zhì)材料分為8類,各種質(zhì)材料分布較平均；相同瓜型的材料有聚集在一起的趨勢(shì),根據(jù)瓜型可將這96份瓠瓜種質(zhì)大致分為3類。

瓠瓜；聚類分析；插入/缺失標(biāo)記；遺傳多樣性

瓠瓜（Lagenaria siceraia（Molina）Standl.）為雌雄同株異花一年生草本植物（2n=2χ=22）,隸屬葫蘆科（Cucurbitaceae）葫蘆屬（Lage naria）,是世界上重要的葫蘆科作物之一［1］。瓠瓜原產(chǎn)赤道非洲南部低地［2］,是人類最早種植的作物之一,1萬(wàn)年前就有考古學(xué)上的證據(jù)表明人類已開始種植瓠瓜。我國(guó)瓠瓜遺傳資源豐富,其栽培史可上溯到新石器時(shí)代,被認(rèn)為是瓠瓜的次生起源中心之一［3］。瓠瓜在我國(guó)主要分布在長(zhǎng)江流域及以南地區(qū),近年來(lái),山東、河北、河南等地也有栽培［4］,可作為瓜果蔬菜食用,既可燒湯做菜,又可腌制曬干；其成熟果還可用作容器或樂(lè)器；此外,瓠瓜可用作嫁接西瓜的砧木,用來(lái)預(yù)防西瓜枯萎?。?,5］。

目前瓠瓜分類主要根據(jù)種質(zhì)資源的表型特征,按形態(tài)分,有圓柱形、牛腿形、手榴彈形等；按大小分,老瓜大的可達(dá)8～10 kg,小的不足0.1 kg；按嫩瓜顏色分,有深綠、淺綠、白色、白底帶花青斑等；按品質(zhì)分有柔滑型、硬肉型（硬于黃瓜）；按口味分,有淡味型、甜味型、清苦型（類似苦瓜之苦味）、劇苦型；按生育期可分為早熟型、中熟型、晚熟型。此外,不同類型、不同品種的長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱、抗病性、抗逆性等也都有差異［6-7］。但目前在DNA水平上檢測(cè)瓠瓜不同種質(zhì)間遺傳多樣性的研究還較少。

我國(guó)瓠瓜生產(chǎn)上以瓠子類品種為主,種質(zhì)來(lái)源局限性大,缺乏遺傳多樣性。近年來(lái)瓠瓜生產(chǎn)中病毒病、白粉病、枯萎病等病害多發(fā),苦味瓜不時(shí)產(chǎn)生,商品瓜性狀多樣性跟不上消費(fèi)者需求等問(wèn)題日益嚴(yán)重,亟需拓寬栽培瓠瓜的遺傳多樣性,以培養(yǎng)新一代良種,為此有必要深入了解我國(guó)現(xiàn)有瓠瓜品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所瓠瓜豇豆組歷年搜集并具有廣泛代性的96份地方品種資源所組成的自然群體。代號(hào)南秀為L(zhǎng) S1,孝感瓠子為L(zhǎng) S2,貴州圓瓠瓜為L(zhǎng) S3,長(zhǎng)瓠為L(zhǎng) S4,龍巖長(zhǎng)四月瓠為L(zhǎng) S5,長(zhǎng)蒲1為L(zhǎng) S6,甬砧1號(hào)為L(zhǎng) S7,新疆瓠瓜為L(zhǎng) S8,東陽(yáng)農(nóng)家種1為L(zhǎng) S9,白葫蘆為L(zhǎng) S10,蕭山園蒲為L(zhǎng) S11,廣東早瓠瓜為L(zhǎng) S12,松桃瓠瓜為L(zhǎng) S13,金錢蒲為L(zhǎng) S14,全化蒲瓜為L(zhǎng) S15,東陽(yáng)農(nóng)家種2為L(zhǎng) S16,四川長(zhǎng)瓠

瓜為L(zhǎng) S17,臨夏瓠子為L(zhǎng) S18,長(zhǎng)蒲2為L(zhǎng) S19,肖長(zhǎng)蒲為L(zhǎng) S20,湖南圓瓠瓜為L(zhǎng) S21,小籽瓠瓜為L(zhǎng) S22,長(zhǎng)蒲3為L(zhǎng) S23,安吉地蒲為L(zhǎng) S24,武都瓠子為L(zhǎng) S25,清秀為L(zhǎng) S26,湖南瓠瓜為L(zhǎng) S27,臺(tái)江瓠瓜為L(zhǎng) S28,津勝特選為L(zhǎng) S29,青砧為L(zhǎng) S30,遼寧瓠子為L(zhǎng) S31,蒲縣瓠瓜為L(zhǎng) S32,新蔡瓠瓜為L(zhǎng) S33,湖南圓瓠1號(hào)為L(zhǎng) S34,G 22②①為L(zhǎng) S35,紹興長(zhǎng)瓜為L(zhǎng) S36,短筒瓠子為L(zhǎng) S37, G 32②②為L(zhǎng) S38,杭州長(zhǎng)瓜為L(zhǎng) S40,云南農(nóng)家種為L(zhǎng) S41,麥瓠為L(zhǎng) S42,小葫蘆為L(zhǎng) S43,新選為L(zhǎng) S44,漢龍青玉為L(zhǎng) S45,長(zhǎng)蒲4為L(zhǎng) S46,極早熟瓠瓜為L(zhǎng) S47,寧波夜開花為L(zhǎng) S48,觀賞瓠子分離出為L(zhǎng) S50,本地義序芋瓠瓜為L(zhǎng) S53,南平青花插桿瓠為L(zhǎng) S54,清流長(zhǎng)芋瓠為L(zhǎng) S55,思南瓠瓜為L(zhǎng) S56,松桃瓠瓜分離為L(zhǎng) S57,貴州長(zhǎng)瓠瓜1為L(zhǎng) S58,長(zhǎng)瓠子為L(zhǎng) S59,湖北瓠子為L(zhǎng) S60,花皮葫蘆分離出為L(zhǎng) S61,永泰圓筒瓠為L(zhǎng) S63,貴州長(zhǎng)瓠瓜2為L(zhǎng) S64,榕江瓠瓜為L(zhǎng) S65,正陽(yáng)瓠瓜為L(zhǎng) S66,湖南早瓠瓜為L(zhǎng) S67,雄溪瓠瓜為L(zhǎng) S68,菜葫蘆為L(zhǎng) S69,三江口葫子為L(zhǎng) S70,瓢葫蘆為L(zhǎng) S71,九山園蒲1為L(zhǎng) S72,麗水農(nóng)家種為L(zhǎng) S73,義烏農(nóng)家種為L(zhǎng) S75,東陽(yáng)農(nóng)家種分1為L(zhǎng) S76,東陽(yáng)農(nóng)家種分2為L(zhǎng) S77,東陽(yáng)農(nóng)家種分3為L(zhǎng) S78,漢龍碧玉為L(zhǎng) S79,葫蘆蒲為L(zhǎng) S80,火焰蒲為L(zhǎng) S81,金華農(nóng)家種為L(zhǎng) S82,九山園蒲2為L(zhǎng) S83,南秀公主為L(zhǎng) S84,爬地蒲為L(zhǎng) S86,青皮圓蒲為L(zhǎng) S87,三山牛腿蒲為L(zhǎng) S88,紹興長(zhǎng)蒲為L(zhǎng) S90,透年蒲為L(zhǎng) S91,腰葫蘆為L(zhǎng) S93,引10-1②②為L(zhǎng) S94,圓葫蘆為L(zhǎng) S95,浙江圓瓠1號(hào)為L(zhǎng) S96,園蒲為L(zhǎng) S97,越蒲1號(hào)為L(zhǎng) S98,云南為L(zhǎng) S99,早熟瓠子為L(zhǎng) S101,砧木為L(zhǎng) S102,08扁蒲-1為L(zhǎng) S103,G 26②①/②為L(zhǎng) S104,J 077-1 I 77①為L(zhǎng) S105和長(zhǎng)條瓠瓜為L(zhǎng) S106。

供試材料經(jīng)浸種、催芽、育苗、移植等一系列處理后,使用改進(jìn)的C T A B法提取基因組DNA［6-8］。

1.2 方法

1.2.1 插入/缺失標(biāo)記的來(lái)源

本試驗(yàn)所使用的插入/缺失標(biāo)記是由瓠瓜豇豆組前期開展的RAD-Seq基因組測(cè)序開發(fā)而來(lái),包括85條差異片段超過(guò)10 bp的多態(tài)性插入/缺失標(biāo)記。

1.2.2 P C R反應(yīng)條件

P C R體系包括10 ng的DNA,2.5 pm o l的引物,2.5 nmol的dN T P s,18.6 nmol的Mg C l2,0.2 U的r T aq酶以及10 xB uf f e r,用水補(bǔ)足體積至12.5 μL。P C R擴(kuò)增程序?yàn)椋孩兕A(yù)變性94℃3 min；擴(kuò)增循環(huán)：②變性94℃30 s,③退火52℃30 s,④延伸72℃40 s,②-④共重復(fù)36個(gè)循環(huán)；⑤72℃延伸5 min,⑥4℃保存。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

P C R產(chǎn)物在室溫條件下使用8%的垂直非變性聚丙烯酰胺凝膠（A c r∶B i s為19∶1或29∶1或39∶1）電泳分離,銀染法染色,拍照分析。根據(jù)電泳結(jié)果記錄清晰可重復(fù)的條帶,將電泳圖中同一位置上清晰且可重復(fù)的不同帶型分別賦值為0,1, 2,以此類推,統(tǒng)計(jì)各引物的多態(tài)性條帶的比率并作進(jìn)一步分析。

1.2.4 遺傳多樣性分析

對(duì)每種基因型在每個(gè)位點(diǎn)上的等位基因數(shù)和出現(xiàn)頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用P I C_C a l c0.6（ht t p：// w w w.e s ni ps.com/do c/9171097b-a c 41-424a-9d35-e 7d 4e 540e c 9f/P i c a l c）計(jì)算每個(gè)插入/缺失位點(diǎn)的P I C值,計(jì)算公式為：其中：Pij代表在第i個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)第j個(gè)等位基因的頻率［9］。使用N T SYSpc 2.10進(jìn)行N e i's遺傳距離計(jì)算（D A）和主坐標(biāo)分析（P C o A）。最后根據(jù)D A的結(jié)果用SA H N程序中的U P G MA法進(jìn)行聚類分析,并用E I G E N程序求特征值和特征向量進(jìn)行主坐標(biāo)分析,用T r e eP l o t模塊生成聚類圖,構(gòu)建分子進(jìn)化樹,用3DP l o t生成主坐標(biāo)圖。

2 結(jié)果與分析

等位基因變異的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和百分率不僅可以反映植物的多態(tài)性指數(shù),而且可以評(píng)價(jià)引物反應(yīng)多樣性信息量的多少。本研究從85條插入/缺失引物中共篩選出22條多態(tài)性較好且能穩(wěn)定擴(kuò)增的引物。不同的引物所產(chǎn)生的條帶數(shù)不同,最多的為8條（如引物插入/缺失-33590）,最少的為1條（如引物插入/缺失-24033）,擴(kuò)增的DNA片段大小范圍為75～500 bp,除了插入/缺失-17370（多態(tài)性條帶大小為500 bp左右）,多態(tài)性條帶大小均為100～200 bp。22條引物共擴(kuò)增出64條帶,其中27條帶表現(xiàn)出多態(tài)性,平均每條引物擴(kuò)增2.78條帶,平均多態(tài)性比例為42.19%（表1）。

基于插入/缺失擴(kuò)增的22個(gè)多態(tài)性標(biāo)記,通過(guò)N T SY S-pc（2.1版）軟件對(duì)96份瓠瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了聚類分析,得到了基于插入/缺失的聚類樹狀

圖（圖1）。瓠瓜種質(zhì)之間的遺傳距離（G D）變幅0～2.54。其中,L S73（麗水農(nóng)家種）和L S82（金華農(nóng)家種）,L S12（廣東早瓠瓜）和L S105（J 077-1 I 77①）,L S2（孝感瓠子）和L S11（蕭山圓蒲）,L S9（東陽(yáng)農(nóng)家種1）和L S103（08扁蒲-1）,L S25（武都瓠子）和L S61（花皮葫蘆分離種）的G D均接近0.00,說(shuō)明它們的親緣關(guān)系極近。

從樹狀圖中并無(wú)明顯可作為分類標(biāo)準(zhǔn)的特性,但可以根據(jù)各種不同的趨勢(shì),將96份瓠瓜種質(zhì)材料在遺傳相似系數(shù)為0.68處分為8類（圖1）。第1類與其他材料相似性系數(shù)最小,僅有0.36,即與其他材料的距離最遠(yuǎn),僅有1份瓠瓜種質(zhì),即來(lái)自遼寧的小葫蘆,該材料瓜型為單腰且較小,瓜長(zhǎng)僅10cm左右。第2類也只有1份種質(zhì),來(lái)自寧夏的臨夏瓠子,瓜型中長(zhǎng)棒形,瓜色綠白,瓜條較長(zhǎng),早熟,該材料與其他材料相比地理來(lái)源較遠(yuǎn),親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。第3類同樣只包括1份瓠瓜材料,為來(lái)自新疆的瓢葫蘆,瓜色淺綠,瓜型為長(zhǎng)把梨形且較小,瓜長(zhǎng)19cm左右,早熟。第4類包括3份材料,分別為來(lái)自浙江的全華蒲瓜、肖長(zhǎng)蒲和杭州長(zhǎng)瓜,瓜型均為長(zhǎng)棒形,瓜色綠色,瓜長(zhǎng)45～50cm,早熟。第5類共有9份材料,均表現(xiàn)為早熟,其中7份材料瓜色為綠白相間,而這7份材料中有5份材料的瓜型均為牛腿形,2份來(lái)自云南的材料也聚集在一起。第6類包括5份材料,分別為清秀、新蔡瓠瓜、麥瓠、南平青花插桿瓠、砧木。這組材料瓜色均表現(xiàn)為綠色,其中除砧木以外的4份材料瓜型為棒形,瓜長(zhǎng)較短,早熟。第7類僅有1份材料,紹興長(zhǎng)蒲,瓜型棒形,瓜色油綠,瓜條較長(zhǎng)（41cm）,熟性較早。余下的75份材料被歸為第8類,以瓜型不同又可細(xì)分為3組,第1組瓜型為棒形（除腰葫蘆外）,包括8份材料,瓜皮綠色,瓜長(zhǎng)中等（25～35cm）,早熟。第2組材料包括17份,瓜型多為牛腿形,近圓形有5份,占到近圓形材料總數(shù)的1/2；瓜色均表現(xiàn)為綠色,瓜長(zhǎng)較短,熟期較晚,僅有的3份晚熟型的材料（火焰蒲、透年蒲和圓葫蘆）均聚集在本組。第3組包括50份材料,來(lái)源較廣泛,瓜型大部分為棒形,瓜色多變,以純綠色為主,本試驗(yàn)中全部9份極早熟材料（蕭山園蒲、長(zhǎng)蒲1、長(zhǎng)蒲2、長(zhǎng)蒲3、長(zhǎng)蒲4、津勝特選、湖南圓瓠1號(hào)、觀賞瓠子分離種）均聚集在本組。

在主成分分析中,沒有明顯的可以作為分類標(biāo)準(zhǔn)的特征,材料較平均地分布于圖中,但相對(duì)于產(chǎn)地而言,相同瓜型的材料有聚集在一起的趨勢(shì)（圖2）。上窄下寬的牛腿形、長(zhǎng)把梨形材料,大部分集中分布在圖左部和右上的位置；近圓形材料在圖上分布較分散,但大部分集中分布在中間靠左的位置；棒筒形材料最多,集中在圖中間部分,這與樹狀圖的結(jié)果基本一致。

表1 插入/缺失引物多態(tài)性分析

3 小結(jié)和討論

我國(guó)瓠瓜資源眾多,遺傳變異非常豐富,但較為全面、系統(tǒng)的遺傳多樣性分析還比較少見。應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)研究分析主栽品種的親本與優(yōu)良品系間的親緣關(guān)系,可為瓠瓜育種實(shí)踐中優(yōu)化親本選配,減少雜交組合數(shù)目,提高品種質(zhì)量及育種效率提供依據(jù)。通常,在闡明種質(zhì)資源的遺傳多樣性后,選擇能最大程度代表物種遺傳多樣性的核心種質(zhì)構(gòu)成核心種質(zhì)庫(kù)是長(zhǎng)期整合、保存種質(zhì)基因資源、方便育種親本選配的重要途徑。

插入/缺失標(biāo)記是指兩親本間在全基因組序列中的差異,在生物的遺傳多樣性分析、純度鑒定、親子分析等方面已有廣泛的應(yīng)用。然而,插入/缺失引物在蔬菜中應(yīng)用較少,在瓜類中更加少見。本研究首次使用插入/缺失引物研究非模式物種---

瓠瓜的遺傳多樣性。Decker-Walters等［10］利用38個(gè)R A P D標(biāo)記研究了世界范圍內(nèi)74個(gè)瓠瓜品系的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)世界范圍內(nèi)瓠瓜可以大洲為界限劃為不同類群,非洲、亞洲的瓠瓜種質(zhì)相對(duì)獨(dú)立,新大陸（美洲）的種質(zhì)起源于非洲,但受到亞洲種質(zhì)的一些影響,而商業(yè)品種由于地理起源和遺傳組成的差異有很大不同,由于這些品種的流通使得難以完整地界定某些品種。Y e t i s i r等［11］利用形態(tài)

學(xué)標(biāo)記研究土耳其的182份瓠瓜的果實(shí)和種子材料,在統(tǒng)計(jì)學(xué)和多變量分析共同研究所得的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)瓜型和大小可以作為區(qū)分瓠瓜亞類的主要標(biāo)準(zhǔn),這與本研究的結(jié)論一致。

圖1 96份瓠瓜材料聚類分析樹狀圖

本研究利用插入/缺失標(biāo)記方法,從分子水平上對(duì)我國(guó)96份瓠瓜資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行研究,可以為我國(guó)瓠瓜資源的合理開發(fā)利用以及進(jìn)一步開展瓠瓜育種研究、指導(dǎo)親本選配提供重要依據(jù)；同時(shí)可為瓠瓜種質(zhì)的分類、核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建,以及瓠瓜種質(zhì)資源的進(jìn)一步收集保存、創(chuàng)新利用提供分子水平上的依據(jù),以縮短瓠瓜育種年限,提高育種效率。

圖2 96份瓠瓜材料插入/缺失聚類分析二維坐標(biāo)圖

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（責(zé)任編輯：高 峻）

Q75文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0528-9017（2014）05-0668-05

2013-11-05

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育專項(xiàng)（2012C 12903）

魯忠富（1963-）,男,浙江杭州人,實(shí)驗(yàn)師,從事蔬菜育種及新品種推廣工作。E-mail：l z f 0522@163.com。

,李國(guó)景。E-mail：l ig j@m a i l.z a a s.a c.c n。

文獻(xiàn)著錄格式：魯忠富,王莎,吳曉花,等.利用插入/缺失標(biāo)記分析我國(guó)瓠瓜資源遺傳多樣性［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（5）：668-672.