夏 志 張 宇 李黔柱 劉 紅

(畢節(jié)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700)

0 前言

過氧化氫(H2O2)是生物體內(nèi)許多氧化酶如葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶和乙醇氧化酶等反應(yīng)的副產(chǎn)物，也是許多工業(yè)生產(chǎn)過程的原料或中間產(chǎn)物，因此通過H2O2的測(cè)定可以間接地測(cè)定其它目標(biāo)物的濃度，對(duì)其含量的測(cè)定在生物、環(huán)境、臨床、工業(yè)和食品分析中具有重要意義[1-2]。目前，測(cè)定H2O2的方法有電化學(xué)法[3-5]、分光光度法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7-8]和滴定法[9]等，其中電化學(xué)方法因其方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、能在線監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)被廣泛關(guān)注，尤其是利用辣根過氧化物酶(HRP)構(gòu)建的H2O2傳感器的報(bào)道尤其多，因?yàn)槊競(jìng)鞲衅骶哂袑Ｒ恍愿?、反?yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。然而，酶?jìng)鞲衅鳠o論怎樣改進(jìn)都要依賴于酶的催化，而酶又有其自身的缺陷，比如，酶的活性會(huì)隨放置的時(shí)間而降低、對(duì)pH值及溫度比較敏感、價(jià)格昂貴、在催化氧化過程中容易受水中溶解氧的干擾等。在將酶固定到電極上時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些問題，如將酶固定到電極上的材料生物相容性不好，致使酶變性；固定到電極表面的酶數(shù)量有限等。因此，構(gòu)建無酶型的傳感器對(duì)進(jìn)一步提高生物傳感器的性能將起到積極的影響。

Hemin是一類重要的有機(jī)共軛分子，可以模擬許多酶的活性中心[10-12]。在生物體內(nèi)，許多金屬蛋白酶經(jīng)常自組裝成納米尺度的超分子結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)其基本的生物催化作用。Hemin可以通過共價(jià)或者非共價(jià)作用有序組裝在納米材料上，實(shí)現(xiàn)其模擬金屬蛋白酶的功能。而且Hemin是良好的電子媒介體，對(duì)生命過程相關(guān)小分子的氧化還原具有較好的電催化活性[13-14]。因此，Hemin納米組裝形成的納米材料復(fù)合物可用于新型電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。

本研究利用Hemin具有模擬酶的這種性質(zhì)，與多壁碳納米管(MWCNTs)通過π-π鍵作用制成Hemin/MWCNTs的納米復(fù)合物，采用滴涂技術(shù)并在nafion的作用下將其固載在電極表面，構(gòu)建nafion/Hemin/MWCNTs修飾的玻碳電極(nafion/Hemin/MWCNTs/GCE)。該修飾電極具有催化作用強(qiáng)、制備簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性及重復(fù)性好等特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華)，KS-250科生牌超聲清洗儀(寧波海曙科生超聲有限公司)，微量進(jìn)樣器(10 mL，上海)，pH計(jì)(上海精科)，X85-2恒溫磁力攪拌器(上海梅穎清)，紫外光譜儀(cary50型)，實(shí)驗(yàn)采用三電極體系(經(jīng)修飾的玻碳電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉑絲電極為對(duì)電極)。

Hemin(C34H33FeN4O5)來自天津市光復(fù)精細(xì)化工廠、MWCNTs、氯化鉀、磷酸和氫氧化鈉均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，H2O2(濃度30%，分析純)購自重慶化學(xué)試劑廠，其余試劑均為分析純。由Na2HPO4-NaH2PO4配制pH值為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.0，8.5，9.0的PBS緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 Hemin/MWCNTs復(fù)合物生物傳感器的制備

將0.05 g的Hemin溶于10 mL氫氧化鈉(2 mol/L)溶液中，再稱取0.05 g的MWCNTs溶于二次蒸餾水中，進(jìn)行超聲后，各取5 mL溶液充分混合。如圖1所示，將5 μL Hemin/MWCNTs的復(fù)合物滴加于玻碳電極的表面，室溫下晾干，最后將2 mL nafion(5%，V/V)滴于電極表面即制得nafion/Hemin/MWCNTs修飾的H2O2生物傳感器。

圖1 修飾電極的制備過程圖Figure 1 Schematic diagram for preparation process of the modified electrode.

2 結(jié)果與討論

2.1 Hemin/MWCNTs納米復(fù)合物的SEM及TEM表征

圖2A為Hemin/MWCNTs復(fù)合物的透射電鏡(TEM)圖?？梢钥吹?，Hemin/MWCNTs復(fù)合物呈管狀且分散均勻；圖2B為Hemin/MWCNTs復(fù)合物的掃描電鏡(SEM)圖，其在電極表面形成了一種疏松多孔的三維雜化結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于保留MWCNTs的優(yōu)良性質(zhì)，促進(jìn)電子的傳輸，并增加電極的有效比表面積。

2.2 UV-Vis光譜表征

采用UV-Vis光譜技術(shù)對(duì)制得的納米復(fù)合物進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，Hemin溶液(b)在390 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰，MWCNTs(c)溶液在248 nm處有明顯的吸收峰，而Hemin/MWCNTs溶液在388 nm及251 nm處均出現(xiàn)了明顯的吸收帶，這表明Hemin/MWCNTs納米復(fù)合物成功地合成了，且各自保持了其良好的性質(zhì)。

圖2 Hemin/MWCNTs納米復(fù)合物的透射電鏡(A)和掃描電鏡圖(B)Figure 2 TEM (A) and SEM (B) images of Hemin/MWCNTs composite.

圖3 Hemin/MWCNTs溶液的UV-Vis光譜表征圖Figure 3 The UV-Vis spectroscopy of Hemin/MWCNTs solution.

2.3 修飾電極的循環(huán)伏安電化學(xué)表征

圖4是不同的修飾電極在pH值為6.0的PBS(0.1 mol/L)中的循環(huán)伏安圖。圖4中a為裸的玻碳電極，沒有明顯的氧化還原峰；當(dāng)修飾有MWCNTs時(shí)(圖4中b)，在0 V左右可以觀察到一對(duì)氧化還原峰，這是MWCNTs的特征峰，說明MWCNTs成功修飾到了電極表面；當(dāng)電極修飾有Hemin/MWCNTs復(fù)合物時(shí)(圖4中c)，在-0.4 V及0 V左右分別有一對(duì)明顯的氧化還原峰，且氧化還原峰的峰電流均有所增大，說明Hemin具有良好的導(dǎo)電性。-0.4 V左右的氧化還原峰為Hemin中Fe3+的氧化還原峰[15]，0 V左右的為MWCNTs的特征峰，說明Hemin/MWCNTs成功修飾到了電極表面。

圖4 不同修飾電極的循環(huán)伏安表征圖Figure 4 Cyclic voltammogram curves of the different modified electrodes.

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

(1)pH值的優(yōu)化

測(cè)試底液的pH值對(duì)生物分子的催化反應(yīng)及其活性有重要影響。圖5考察了修飾電極在pH=3.5～9.0的PBS(0.1 mol/L)緩沖溶液中對(duì)H2O2的響應(yīng)。改變pH值，采用計(jì)時(shí)電流法記錄其電流響應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)pH值由3.5升至6.0時(shí)，電極電流響應(yīng)逐漸增加；當(dāng)pH>6.0后，電流響應(yīng)開始下降，且電極變得不穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選用的pH=6.0的PBS為測(cè)試底液。

(2)掃描速率的選擇

圖6是Hemin/MWCNTs復(fù)合物修飾玻碳電極在含有H2O2(3.5×10-1mol/L)的PBS(pH=6.0)中，在-0.6～0.0 V電位范圍內(nèi)，以不同掃描速度進(jìn)行掃描的循環(huán)伏安圖。從圖6中可以看出，隨著掃描速度的不斷增加，氧化還原峰電流均明顯增大，在10～100 mV/s范圍內(nèi)氧化還原峰電流值與掃描速率呈良好的線性關(guān)系(見插圖6B)，氧化峰 和還原峰的關(guān)系式分別為 ：ipa=1 463.2v+2.1796，相關(guān)系數(shù)R=0.999；ipc=-1 506v-6.990 1，其相關(guān)系數(shù)R=0.999，其中：ipa和ipc為峰電流，單位為mA；v為電壓掃描速率，單位為V/s。說明此修飾電極在電化學(xué)過程是受擴(kuò)散控制的。

圖5 pH值對(duì)修飾電極響應(yīng)電流的影響Figure 5 Influence of pH on current response of a modified electrode.

(3)傳感器響應(yīng)性能的研究

如圖7所示，當(dāng)溶液中分別加入10 μL過氧化氫(3.5×10-1mol/L)時(shí)，Hemin/MWCNTs修飾電極在-0.2 V下電流有明顯的增加，說明在該電位下修飾電極對(duì)H2O2有較高的靈敏度。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)原理如下[16-17]：

Hemin(Fe3+)+H2O2→Compound I (Fe4+=O)+H2O

Compound I(Fe4+=O)+H++e-→Compound II

Compound II+H++e-→Hemin(Fe3+)+H2O

圖6 (A)Hemin/MWCNTs修飾玻碳電極在不同掃描速率下的循環(huán)伏安圖 (B)為掃描速率與峰電流的線性關(guān)系圖Figure 6 (A)Cyclic voltammongram curves of MWCNTs/Hemin/GCE at different scanning rates (pH=6.0). (B) The peak current vs scan rate.

圖7 修飾電極對(duì)H2O2的循環(huán)伏安響應(yīng)圖Figure 7 CV responses of the modified electrode to H2O2.

圖8是在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，修飾電極對(duì)在PBS中分別加入不同濃度的H2O2時(shí)的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)圖，從圖中可知該修飾電極對(duì)H2O2有較高的靈敏度，響應(yīng)時(shí)間較快(5 s)。H2O2低濃度時(shí)的響應(yīng)電流比較平坦，隨著H2O2濃度的增大，響應(yīng)電流增加幅度增大。H2O2濃度在0.8～1.8 mmol/L的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2=0.992 2)，線性方程為i=-70.698C-28.863，其中i為響應(yīng)峰電流，單位為μA；C為H2O2的濃度，單位為mmol/L。檢測(cè)下限可達(dá)到0.2 mmol/L。

圖8 優(yōu)化條件下修飾電極對(duì)H2O2 的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)圖Figure 8 Timing amperometric response of the modified electrode to H2O2 under optimal conditions.

2.5 電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

用同一支電極對(duì)3.5×10-1mol/L的H2O2溶液連續(xù)測(cè)定20次，其電流響應(yīng)相對(duì)偏差為2.3%，在同樣條件下制備7支修飾電極，其電流響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%，表明Hemin/MWCNTs修飾電極對(duì)H2O2有較好的重現(xiàn)性。將電極置于H2O2(3.5×10-1mol/L)溶液中連續(xù)掃描100圈，峰電流僅下降5.2%，表明此電極具有良好的操作穩(wěn)定性，試驗(yàn)后將電極置于4 ℃下懸于pH值為6.0的PBS上方保存，14 d內(nèi)的電流沒有明顯變化，28 d后的響應(yīng)電流為原來的89%，說明該電極具有較好的儲(chǔ)備穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

利用Hemin與MWCNTs之間的π-π鍵作用，在超聲分散下制備Hemin/MWCNTs納米復(fù)合物；采用滴涂技術(shù)并在nafion的作用下將其固載在電極表面，制得一種全新的H2O2生物傳感器(nafion/Hemin/MWCNTs/GCE)。實(shí)驗(yàn)表明，Hemin對(duì)H2O2具有較好的催化作用，MWCNTs的加入有效地增加了電極的比表面積，促進(jìn)電子傳遞，提高電極的靈敏度。在檢測(cè)中，該傳感器表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性、較低的檢出限和較寬的檢測(cè)范圍。Hemin/MWCNTs所表現(xiàn)出的高穩(wěn)定性和催化活性使其在各種生物傳感器、生物電子器件以及催化劑等方面具有廣泛的潛在應(yīng)用前景。

[1] Chandrakant K T,Sreekantha R D,Rohini A,et al. Green synthesis of silver nanoparticles and their application for the development of optical fiber based hydrogen peroxide sensor[J].Sensors and Actuators B: Chemical, 2013(183):144-149.

[2] Miao Y E,He X, Zhong Y,et al. A novel hydrogen peroxide sensor based on Ag/SnO2composite nanotubes by electrospinning[J], J, Electrochimica Acta, 2013(99):117-123.

[3] Liu M, Liu R, Chen W. Graphene wrapped Cu2O nanocubes: Non-enzymatic electrochemical sensors for the detection of glucose and hydrogen peroxide with enhanced stability[J].Biosensors and Bioelectronics,2013(45):206-212.

[4] 劉敏敏,魏文濤,逯一中,等.石墨烯負(fù)載的空心銀鈀納米粒子的制備及其在過氧化氫檢測(cè)中的應(yīng)用[J].分析化學(xué),2012,40(10):1477-1481.

[5] Lu Q, Dong X, Li L,et al. Direct electrochemistry-based hydrogen peroxide biosensor formed from single-layer graphene nanoplatelet-enzyme composite film[J].Talanta, 2010(82):1344-1348.

[6] Pa′zdzioch-Czochra M, Wide′nska A. Spectrofluorimetric determination of hydrogen peroxide scavenging activity[J].Analytica Chimica Acta, 2002(452):177-184.

[7] Hanaoka S, Lin J.M, Yamada M. Chemiluminescent flow sensor for H2O2based on the decomposition of H2O2catalyzed by cobalt(II)-ethanolamine complex immobilized on resin[J].Analytica Chimica Acta,2001(426):57-64.

[8] 陳志兵,查珺,宋倩,等.谷胱甘肽穩(wěn)定的CdTe量子點(diǎn)熒光猝滅法測(cè)定痕量過氧化氫[J].中國(guó)無機(jī)分析化學(xué), 2012,2(2):10-13.

[9] Aslan K, Malyn S.N, Geddes C. D. Multicolor microwave-triggered metal-enhanced chemiluminescence[J]. J. Am. Chem. Soc, 2006(128):13372-13373.

[10] Zhang S, Tang S, Lei J,et al. Functionalization of graphene nanoribbons with porphyrin for electrocatalysis and amperometric biosensing[J]. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2011(656):285-288.

[11] 羅賢,呂桂琴. 金屬卟啉與Keggin型硅鎢酸修飾電極的制備及電催化性能測(cè)定[J].無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(9):1705-1708.

[12] Wu L, Lei J, Zhang X,et al. Biofunctional nanocomposite of carbon nanofiber with water-soluble porphyrin for highly sensitive ethanol biosensing[J]. Biosensors and Bioelectronics,2008(24):644-649.

[13] Tu W,Lei J,Ju H. Noncovalent nanoassembly of porphyrin on single-walled carbon nanotubes for electrocatalytic reduction of nitric oxide and oxygen[J].Electrochemistry Communications,2008(10):766-769.

[14] Shao M F, Han J B, Shi W Y,et al. Layer-by-layer assembly of porphyrin/layered double hydroxide ultrathin film and its electrocatalytic behavior for H2O2[J].Electrochemistry Communications,2010(12):1077-1080.

[15] Wang C,Yuan R,Chai Y.Q,et al. Non-covalent iron(III)-porphyrin functionalized multi-walled carbon nanotubes for the simultaneous determination of ascorbic acid, dopamine, uric acid and nitrite[J].Electrochimica Acta,2012(62):109-115.

[16] Zhang Y,Xia Z,Liu H,et al. Hemin-graphene oxide-pristine carbon nanotubes complexes with intrinsic peroxidase-like activity for the detection of H2O2and simultaneous determination for Trp, AA, DA, and UA[J].Sensors and Actuators B: Chemical, 2013(188):496-501.

[17] Santo W J R, Lima P R, Tarley C R T.Synthesis and application of a peroxidase-like molecularly imprinted polymer based on hemin for selective determination of serotonin in blood serum[J].Analytica Chimica Acta, 2009(631):170-176.