郭文靜 劉曉俠 鄧凡政

(淮北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 安徽 淮北 235000)

0 引言

近年來，研究證實(shí)稀土氨基酸配合物具有殺菌、消炎、抗凝血和降血糖等作用，稀土與核酸配位后對維護(hù)核酸構(gòu)型穩(wěn)定性有重要作用[1]。血清白蛋白對許多外源性和內(nèi)源性的物質(zhì)具有轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲(chǔ)的功能，是血漿中重要且含量最豐富的載體蛋白質(zhì)，能維持正常的血漿滲透壓，是血液緩沖劑。人們對血清白蛋白與各種物質(zhì)的相互作用展開了大量的研究工作，其中研究稀土金屬離子對血清白蛋白的作用機(jī)理以及對血清白蛋白結(jié)構(gòu)的影響等方面已成為生物無機(jī)化學(xué)的一個(gè)重要課題。因此研究稀土氨基酸配合物與血清白蛋白相互作用，對于了解稀土離子在人體內(nèi)的代謝過程以及生物效應(yīng)的作用機(jī)理意義重大。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

X射線衍射儀D8 Advance(德國，bruker)；傅立葉紅外光譜儀NEXUS670(美國尼高力儀器公司)；FP-8300熒光分光光度計(jì)(日本分光株式會(huì)社)；pHSJ-3CT型酸度計(jì)(上海今邁儀器儀表有限公司)；XW-80A型漩渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。

牛血清白蛋白(BSA)溶液(10-4mol/L)：4 ℃冰箱中保存；氧化鑭，固體；甘氨酸，固體；NaCl溶液(0.5 mol/L)；伯瑞坦-羅賓森(B-R)緩沖溶液(pH=7.4)。所用實(shí)驗(yàn)用水為超純水，試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確稱取一定量灼燒后的氧化鑭，用硝酸(1+1)溶解，制備硝酸鑭溶液。按甘氨酸與硝酸鑭摩爾比為3∶1，稱取甘氨酸放入硝酸鑭溶液的燒杯中，在70 ℃的水浴中攪拌7 h，室溫冷卻，二次重結(jié)晶后置于干燥器中干燥至恒重?？芍频门浜衔風(fēng)a(NO3)3·(Gly)3·H2O[2]。

在比色管中加入0.5 mL BSA，2.0 mL的B-R緩沖溶液，2.0 mL的NaCl溶液，不同體積的配合物，用水定容到10.0 mL，混勻靜置30 min。熒光掃描的范圍為290～500 nm，在此范圍內(nèi)測定熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘氨酸鑭配合物紅外光譜

圖1.1和1.2分別為甘氨酸及配合物紅外光譜圖(FT-IR)，由圖中可以得出甘氨酸中的NH3+和COO-基團(tuán)所具有的特征峰在配合物中仍然保留，但峰的位置有較大的位移，甘氨酸中NH3+的伸縮振動(dòng)(2 904 cm-1)、反對稱彎曲振動(dòng)(1 594 cm-1)，COO-的對稱伸縮振動(dòng)(1 410 cm-1)、反對稱伸縮振動(dòng)(1 522 cm-1)，而配合物中NH3+的伸縮振動(dòng)(3 185 cm-1)、反對稱彎曲振動(dòng)(1 476 cm-1)，COO-的對稱伸縮振動(dòng)消失、反對稱伸縮振動(dòng)(1 603 cm-1)。說明了甘氨酸中NH3+，COO-基團(tuán)參與了配位。

圖1.1 Gly的FT-IR光譜圖 Figure 1.1 FT-IR spectrum of Gly.

圖1.2 La(NO3)3·(Gly)3·H2O的FT-IR光譜圖Figure 1.2 FT-IR spectrum of La(NO3)3·(Gly)3·H2O.

2.2 甘氨酸鑭配合物X射線衍射

由圖2.1和2.2表明，甘氨酸衍射峰位置及強(qiáng)度與配合物的衍射峰位置及強(qiáng)度有很大的差異，因此說明這些配合物是新生成的化合物，而不是甘氨酸與硝酸鑭的混合物。

圖2.1 Gly的XRD圖譜 Figure 2.1 XRD spectrum of Gly.

圖2.2 La(NO3)3·(Gly)3·H2O的XRD 圖譜.Figure 2.2 XRD spectrum of La(NO3)3·(Gly)3·H2O.

2.3 甘氨酸鑭配合物對蛋白質(zhì)的熒光猝滅類型

BSA中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等氨基酸殘基的存在具有內(nèi)源性熒光，加入甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物后BSA的熒光強(qiáng)度明顯降低，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，表明BSA與甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物存在相互作用?？刂艬SA的含量，不斷的增加甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物的濃度，由圖3可見，BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律降低。對于動(dòng)態(tài)猝滅，其機(jī)理過程符合Stem-Volmer方程(1)[3]。

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

其中F0是沒有猝滅劑的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)是加入猝滅劑的熒光強(qiáng)度；[Q]是猝滅劑的濃度；Kq是雙分子猝滅速率常數(shù)，單位為L/(mol·s)；Ksv為Stern-Volmer方程的猝滅常數(shù)，是雙分子猝滅的速率常數(shù)和單分子衰變的速率常數(shù)的比；τ0是沒有加入猝滅劑時(shí)侯生物大分子的平均熒光壽命。以F0/F對[Q]作圖，求得不同溫度下的Ksv見表1?？梢钥闯鲭S溫度升高，Ksv減小，對于動(dòng)態(tài)猝滅而言，升高溫度將加劇電子轉(zhuǎn)移及增加有效碰撞，溫度的升高使猝滅常數(shù)變大[4]。又根據(jù)式Kq=Ksv/τ0求出的猝滅速率常數(shù)Kq，不同種類猝滅劑對于生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)是2.0×1010L/(mol·s)，從表1中數(shù)據(jù)知甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物對于 BSA的猝滅速率常數(shù)全大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)，這可以證明猝滅是形成了復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅，而不是動(dòng)態(tài)猝滅。

圖3 熒光猝滅光譜圖Figure 3 Fluorescence quenching spectra.CBSA=0.5×10-6 mol/L；C配合物(1～11)=0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4，2.7，3.0(×10-3 mol/L)

對于靜態(tài)猝滅Lineweaver-Burk方程[5]為最常用方程(2)，此式指出了F，[Q]，Kb，n之間的關(guān)系。

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(2)

用lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖，通過斜率和截距可以計(jì)算出Kb與n列于表1中。由數(shù)據(jù)可知甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物與蛋白質(zhì)分子有很強(qiáng)烈的相互作用，且甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物與蛋白質(zhì)分子間存在1～2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 甘氨酸鑭配合物與牛血清白蛋白的作用力類型

通常生物大分子和藥物分子的相互作用力類型包含靜電引力，范德華力，疏水作用力，氫鍵等。由蛋白質(zhì)和甘氨酸鑭配合物之間反應(yīng)前后的熱力學(xué)參數(shù)熵變?chǔ)和焓變?chǔ)的相對大小來判斷兩者的主要作用力類型。根據(jù)Klotz等總結(jié)的規(guī)律[6]，當(dāng)反應(yīng)的焓變?chǔ)>0、熵變?chǔ)>0時(shí)，反應(yīng)為吸熱過程，分子間的結(jié)合力主要來自于疏水作用力；當(dāng)反應(yīng)的焓變?chǔ)<0、熵變?chǔ)>0時(shí)，反應(yīng)為放熱過程，分子間的結(jié)合力主要為靜電力；當(dāng)反應(yīng)的熵變?chǔ)<0、焓變?chǔ)<0的時(shí)侯，反應(yīng)為放熱過程，分子之間的相互作用力類型為范德華力與氫鍵。當(dāng)溫度變化不大的時(shí)候，蛋白質(zhì)與配合物結(jié)合反應(yīng)的焓變?chǔ)可以視為常數(shù)。由甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物與BSA的結(jié)合常數(shù)Kb并結(jié)合公式(4)求得反應(yīng)的吉布斯自由能變?chǔ)，根據(jù)方程式(3)和(5)計(jì)算出反應(yīng)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，有關(guān)熱力學(xué)數(shù)據(jù)見表1。不同溫度下都有ΔG<0，可以推斷出配合物與BSA的結(jié)合反應(yīng) 自發(fā)過程。ΔH>0，ΔS>0則甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物與BSA分子間的作用力主要為疏水作用力。

(3)

ΔG=-RTlnKb

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

2.5 配合物對牛血清白蛋白構(gòu)象的影響

由Δλ=15 nm所作出的同步熒光光譜僅表現(xiàn)酪氨酸殘基的熒光，而Δλ=60 nm所作出的同步熒光光譜僅顯示出色氨酸殘基的熒光[7]。由于殘基所在的微環(huán)境發(fā)生變化會(huì)影響蛋白質(zhì)的最大發(fā)射波長，所以蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變可以通過發(fā)射波長的變化來判斷。如果最大發(fā)射峰出現(xiàn)藍(lán)移說明蛋白質(zhì)中氨基酸殘基微環(huán)境的疏水性增加，最大發(fā)射峰出現(xiàn)紅移則說明蛋白質(zhì)中氨基酸殘基微環(huán)境極性增加。固定BSA的濃度不變，甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物的濃度逐漸增加，得到BSA的同步熒光光譜圖，見圖4。由圖可見隨甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物濃度的增大，酪氨酸殘基的特征光譜峰沒有發(fā)生位移，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生了微弱的藍(lán)移，這個(gè)結(jié)果表明蛋白質(zhì)中色氨酸殘基所在的微環(huán)境疏水性增加，蛋白質(zhì)的構(gòu)象也因而發(fā)生了改變。

表1 La(NO3)3·(Gly)3·H2O與BSA作用的猝滅常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching constants and thermodynamic parameters for the interaction betweenLa(NO3)3·(Gly)3·H2O and BSA

圖4 配合物對BSA同步熒光光譜的影響Figure 4 Effect of La(NO3)3·(Gly)3·H2O on synchronous fluorescence spectra of BSA.CBSA=5×10-6 mol/L；C配合物(1～11)=0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4，2.7，3.0(×10-3 mol/L)

3 結(jié)論

紅外光譜表明甘氨酸中NH3+，COO-基團(tuán)參與了與鑭(Ⅲ)配位，X射線衍射分析進(jìn)一步說明配合物是新生成的化合物。利用熒光光譜法獲得甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物與BSA相互作用引起B(yǎng)SA熒光猝滅，且屬于靜態(tài)猝滅。熱力學(xué)計(jì)算結(jié)果表明甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物和BSA相互作用是自發(fā)進(jìn)行的及兩者之間相互作用力主要為疏水作用力。由同步熒光光譜圖可知甘氨酸鑭(Ⅲ)配合物使得BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化，色氨酸殘基所在微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)。

[1] 劉湘虎.稀土元素對動(dòng)物及人的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2008,35(8):158-159.

[2] 何地平,韓維和,刁琳琳.稀土甘氨酸配合物的制備及表征[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào),2011,39(1):45-48.

[3] 馬貴斌,高飛,任斌知.熒光法研究藥物分子與人血清白蛋白的結(jié)合作用[J].化學(xué)學(xué)報(bào),1995,53(12):1193-1197.

[4] 趙錦,王志,吳秋華.應(yīng)用熒光光譜法和紫外光譜法研究士的寧與牛血清白蛋白的相互作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2006,41(7):666-670.

[5] 楊曼曼,楊頻,張立偉.熒光法研究咖啡酸類藥物與白蛋白的作用[J].科學(xué)通報(bào),1994,39(1):31-35.

[6] KOWSKA A S.Interaction of drugs with bovine and human serum albumin[J].J Mol Struct,2002,614:227-232.

[7] Yang P,Yang MM,Yang BS.The fluorescence enhancement and the action between donor and acceptor[J].Chin J Chem ,1996,14(2):109-113.