陳惠苑，張郅灝，黃藝

1. 北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871；2. 北京大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518055

微囊藻毒素對(duì)真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒害效應(yīng)的研究

陳惠苑2，張郅灝2，黃藝1,2

1. 北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871；2. 北京大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518055

主要探討微囊藻毒素對(duì)真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒害效果，以及其作為水體生理毒害評(píng)價(jià)模式細(xì)胞的可能。通過(guò)毒性試驗(yàn)和單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，利用栗酒裂殖酵母細(xì)胞（S.pombe），人肝癌細(xì)胞（HepG2）和人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞癌細(xì)胞（U87）3種生物模型評(píng)估MC對(duì)細(xì)胞DNA的損傷以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化自由基水平的影響。并利用栗酒裂殖酵母的基因缺失體，判斷MC所誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞氧化應(yīng)激路徑。研究表明MC通過(guò)氧化路徑誘導(dǎo)DNA損傷；缺失wis1△和pap1△基因的S.pombe細(xì)胞無(wú)法誘導(dǎo)ROS生產(chǎn)，wis1△和pap1△缺失型S.pombe細(xì)胞在40 mg·L-1-1MC暴露24 h下細(xì)胞增殖率僅下降7.3%、7.7%；氧化損傷是MC損傷S.pombe的主要方式；HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞較S.pombe細(xì)胞適于研究、評(píng)估MC的毒性。

MC；栗酒裂殖酵母；肝細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞；細(xì)胞毒性；基因損傷

微囊藻毒素（Microcystin，MC）是自然水體中存在最普遍的對(duì)人體健康危害最大的一類(lèi)藻毒素。MC為7個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，因多肽中可變氨基酸組成的不同，又分為MC-LR、MC-RR、MC-YR等。其中，MC-LR和MC-RR是我國(guó)天然水體中檢出率最多和含量最高的MC類(lèi)型（宋立榮等，1999；閆海等，2002）。MC對(duì)生物細(xì)胞毒害的毒害主要有：直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引發(fā)細(xì)胞溶解；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Dietrich和Hoeger，2005）；誘導(dǎo)細(xì)胞癌變（張萍等，2009）；誘導(dǎo)基因突變和DNA損傷等（Gaudin等，2008）。

現(xiàn)在制定的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，一般以水體中污染物的濃度作為基礎(chǔ)，如OECD給出的飲用水標(biāo)準(zhǔn)中，微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)是不大于0.001 mg·mL-1。然而，許多研究顯示，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溶于水的微囊藻毒素和在自然水體中的微囊藻毒素對(duì)于生物和人體的毒性強(qiáng)度有很大的不同（王偉琴，2010）。這就使得以濃度為基礎(chǔ)制定的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，在水體的健康風(fēng)險(xiǎn)控制和管理方面，具有一定的局限性。如果能找到直接對(duì)水體中的微囊藻毒素有明顯和容易觀(guān)察的毒性反應(yīng)，且容易培養(yǎng)易于操作的指示生物，用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)水體微囊藻毒素的生物毒害，對(duì)于自然水體的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

栗酒裂殖酵母細(xì)胞擁有已知最小的真核生物基因組，且沒(méi)有大范圍基因重復(fù)，其中有約145個(gè)基因在后生動(dòng)物中有同源基因，50個(gè)基因與人類(lèi)致病基因顯著相似，其中25個(gè)基因和致癌因子相關(guān)，與人類(lèi)在進(jìn)化上相似?？梢?jiàn)其適合作為真菌毒害效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的代表細(xì)胞（Wood V等，2003）。人體肝癌細(xì)胞來(lái)源于肝細(xì)胞，表型與肝細(xì)胞極為相似并保留了肝細(xì)胞大部分生物學(xué)特性（陳秋等，2005）。人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞癌細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中常用的動(dòng)物模式細(xì)胞之一（Marie T等，2014）。因此，該論文選擇與人體細(xì)胞同源性較高的栗酒裂殖酵母細(xì)胞，以及微囊藻毒素直接作用的人體神經(jīng)和肝細(xì)胞，通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞受損程度，研究其對(duì)不同濃度微囊藻毒素MC的毒性反應(yīng)，并對(duì)這3種生物細(xì)胞的DNA損傷和氧化應(yīng)激效應(yīng)進(jìn)行初步研究，探討其成為快速檢測(cè)和評(píng)價(jià)水體微囊藻毒素生物毒害指示生物的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人體肝癌細(xì)胞（HepG2）和人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞癌細(xì)胞（U87），由陜西師范大學(xué)夏海濱教授饋贈(zèng)；野生型栗酒裂殖酵母菌株（Schizosaccharomyces pombe，簡(jiǎn)稱(chēng)S. pombe）以及缺失型spc1△、atf1△、pmk1△、wis1△和pap1△ S.pombe細(xì)胞均由美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校Kazshiozaki教授饋贈(zèng)。微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品（Microcystin-LR，Microcystin-RR），購(gòu)于瑞士Alexis公司。

細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2和U87細(xì)胞，按Kataoka等（2010）陳述的條件進(jìn)行培養(yǎng)。S. pombe細(xì)胞按Methods in Enzymology（1991）中介紹的方法培養(yǎng)。3種細(xì)胞暴露在MC-LR中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)；

S. pombe細(xì)胞去壁：使用Zymolyase 20T生物酶將細(xì)胞壁消化溶解，獲得S. pombe原生質(zhì)體。具體方法參照Lantermann等（2009）的S.pombe破壁方法。

1.2 單細(xì)胞凝膠電泳（彗星實(shí)驗(yàn)）

將110 μL的0.8%正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(Normal Melting Point Agarose Gel, NMP)滴于全磨砂載波片上，其后用蓋玻片平鋪蓋上。于4 ℃固定5 min后，輕輕移走蓋玻片；取10 μL經(jīng)破壁的細(xì)胞懸濁液和65 μL 1.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(Low Melting Point Agarose Gel, LMP)，在37 ℃水浴中進(jìn)行混合后，滴于第一層NMP上，蓋上蓋玻片，于4 ℃固定5 min，其后移走蓋玻片。將覆有2層膠的載玻片放入細(xì)胞裂解液中，靜置2 h后，再移入4 ℃電泳緩沖液中，浸泡20 min；將載玻片移出，再放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中，通過(guò)調(diào)節(jié)液面，使電流為300 mA，電壓為30V（0.86Vcm），4 ℃電泳20 min；電泳后，將載玻片放入TE緩沖液，浸泡15 min；e.取出載玻片，在每塊凝膠上加入40 μL的20 μg·mL-1EB染液，晾干；正置熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照。

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

以終濃度為0、1、2、5、10、20、40 mg·L-1的MC-LR分別處理96孔板內(nèi)的對(duì)數(shù)期S. pombe細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞。然后將細(xì)胞置于30 ℃，200 rmp的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于0、 2、4、6、8、10、12、14 h測(cè)定S. pombe的OD600值；于0、24、48、72 h測(cè)定以MTT法測(cè)定HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞的細(xì)胞活性，試驗(yàn)重復(fù)5次。以上操作均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。

將分S.pombe細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞分別暴露于濃度為5 mg·L-1和40 mg·L-1的MC-LR 6 h，然后通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳分別測(cè)定和計(jì)算3種細(xì)胞的DNA尾長(zhǎng)、尾DNA百分比、尾距及Oliver尾矩，研究MC-LR對(duì)DNA對(duì)損傷。

將野生型S.pombe細(xì)胞和缺失型spc1△、atf1△、pmk1△、wis1△和pap1△ S.pombe細(xì)胞分別暴露于濃度為5 mg·L-1與40 mg·L-1的MC-LR下24 h，觀(guān)察增殖率和ROS熒光強(qiáng)度，分析MC-LR對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化自由基的誘導(dǎo)程度。

2 結(jié)果

前期實(shí)驗(yàn)表明，MC-LR與MC-RR對(duì)栗酒裂殖酵母細(xì)胞、人體神經(jīng)和肝細(xì)胞的毒性基本一致，生長(zhǎng)率差在24 h內(nèi)低于0.5%。MC-LR與MC-RR濃度越高，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)差異越大。當(dāng)暴露濃度為40 mg·L-1，暴露時(shí)間達(dá)到14 h時(shí)，MC-LR與RR對(duì)3種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制的差異低于2.5%。因此，在后續(xù)生物毒性和毒性機(jī)理研究中，只對(duì)MC-LR一種物質(zhì)做暴露實(shí)驗(yàn)。

2.1 MC-LR對(duì)細(xì)胞活性的影響

不同濃度的MC-LR對(duì)S.pombe細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不同，見(jiàn)圖1、表1。當(dāng)S.pombe暴露于濃度低于5 mg·L-1的MC-LR時(shí)，抑制效果在8 h處達(dá)到頂點(diǎn)，隨后緩慢回落。濃度為10 mg·L-1的MC-LR對(duì)S.pombe生長(zhǎng)抑制效果頂點(diǎn)為暴露后8 h，最大抑制率11%，隨后抑制率則迅速回落，在14 h時(shí)降至1%。20 mg·L-1、40 mg·L-1的MC-LR對(duì)S.pombe細(xì)胞在14 h內(nèi)持續(xù)被抑制，最終抑制率分別達(dá)到21%和16%。不同濃度MC-LR作用下的S.pombe細(xì)胞生長(zhǎng)率在各時(shí)間段p值均小于0.05，說(shuō)明數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 暴露于MC-LR的S.pombe細(xì)胞14 h內(nèi)的增殖百分比Fig. 1 Growth rate of S. pombe treated with MC-LR in 14 h

表1 S.pombe細(xì)胞在不同濃度MC-LR作用2、4、6、8、10、12、14 h的方差分析結(jié)果Table 1 Variance analysis of S.pombe cell treated with MC-LR in 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 h

不同濃度的MC-LR能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增值，且呈時(shí)間劑量反應(yīng)關(guān)系，不同濃度MC-LR作用下的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)率在各時(shí)間段p值均小于0.05，說(shuō)明數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖2、表2。HepG2細(xì)胞在暴露于40 mg·L-1的MC-LR72 h后，細(xì)胞活性增漲了15%，20 mg·L-1及10 mg·L-1處理組的增長(zhǎng)率也分別達(dá)到5%和8%。低劑量組MC-LR對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響基本一致，在72 h內(nèi)都未出現(xiàn)顯著的抑制或促進(jìn)作用。

圖2 暴露于MC-LR的HepG2細(xì)胞72 h內(nèi)的增殖百分比Fig. 2 Growth rate of HepG2 treated with MC-LR in 72 h

表2 HepG2細(xì)胞在不同濃度MC-LR作用24、48、72 h的方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of HepG2 cell treated with MC-LR in 24, 48, 72 h

不同濃度的MC-LR能抑制U87細(xì)胞的增值，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系，不同濃度MC-LR作用下的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)率在各時(shí)間段p值均小于0.05，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖3、表3。暴露于40 mg·L-1的MC-LR 24 h，U87細(xì)胞活性明顯降低，抑制率為20%，隨后抑制率則隨時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，72 h暴露終點(diǎn)處的抑制率為16%。20 mg·L-1MC-LR處理組的抑制率也在24 h達(dá)到頂點(diǎn)，為12%，隨后不斷下降。其余低劑量組抑制現(xiàn)象并不明顯，最高抑制率均在10%以?xún)?nèi)。顯微鏡下觀(guān)察暴露72 h后的U87細(xì)胞，隨處理濃度的增加，活細(xì)胞數(shù)與活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分比均明顯下降。死亡細(xì)胞形態(tài)由纖維狀變?yōu)橐?guī)則球體，其形態(tài)特征與凋亡一致，因此MC-LR是通過(guò)誘導(dǎo)U87凋亡而導(dǎo)致其死亡的。經(jīng)MC-LR處理后72 h后的U87細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示見(jiàn)表4，隨著MC-LR處理濃度的提升，同視野內(nèi)的U87總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)都呈下降趨勢(shì)，細(xì)胞存活率也不斷降低。

表3 U87細(xì)胞在不同濃度MC-LR作用24、48、72 h的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of U87 cell treated with MC-LR in 24, 48, 72 h

圖3 暴露于MC-LR的U87細(xì)胞72 h內(nèi)的增殖百分比Fig. 3 Growth rate of U87 treated with MC-LR in 72 h

表4 MC-LR處理U87細(xì)胞24 h后活細(xì)胞及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 4 Number of live and apoptotic U87 cell treated with MC-LR after 24 h

2.2 MC-LR對(duì)DNA的損傷

通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)又稱(chēng)為彗星實(shí)驗(yàn)，是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)真核細(xì)胞DNA損傷的方法（蔡麗敏和李雪峰，2011）。該方法將待檢測(cè)細(xì)胞埋于LMP，通過(guò)細(xì)胞裂解液破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜，使得細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)等成分經(jīng)由凝膠擴(kuò)散進(jìn)入裂解液中，胞內(nèi)DNA仍附著在原位的核骨架上。若檢測(cè)細(xì)胞DNA未受損傷，經(jīng)電泳后無(wú)拖尾現(xiàn)象；若細(xì)胞DNA受損，斷裂的DNA片段便會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠，經(jīng)電泳后向陽(yáng)極定向遷移，形成形似彗星的拖尾，且受損程度越高，拖尾越長(zhǎng)，比例也越高。正置熒光顯微鏡以紅光波長(zhǎng)范圍535 nm下檢測(cè)經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞，照相。使用CASP軟件分析受損DNA，對(duì)DNA尾長(zhǎng)、尾DNA百分比、尾距及Oliver尾矩4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行圖像分析（朱志良等，2011）來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞DNA的損傷。因?yàn)樵摲椒ㄓ^(guān)察了DNA的受損情況，是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)“三致”效應(yīng)的有效方法。

在前期生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種細(xì)胞在低劑量（1、2、5 mg·L-1）和高劑量（20、40 mg·L-1）MC-LR暴露下，抑制情況有明顯差異。故選取暴露于5 mg·L-1、40 mg·L-1的MC-LR 6時(shí)后，分別檢測(cè)S.pombe細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞的DNA尾長(zhǎng)、尾DNA百分比、尾距及Oliver尾矩變化，并列于表5。

經(jīng)MC-LR暴露后，3種細(xì)胞的DNA尾長(zhǎng)、尾DNA百分比、尾距及Oliver尾矩都有一定增大。如當(dāng)MC-LR濃度增加8倍的時(shí)候，S.pombe細(xì)胞的尾長(zhǎng)增加一倍。這些結(jié)果表明，彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)苊鞔_顯示出MC-LR對(duì)3種細(xì)胞所產(chǎn)生的DNA損傷，由Olive尾矩和尾距所表達(dá)的損傷作用隨劑量的增加而增加，有明顯的劑量響應(yīng)關(guān)系。其中，HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞所表達(dá)的劑量響應(yīng)關(guān)系更加明確。

ROS熒光檢測(cè)探針DHE方法是利用可自由通過(guò)活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的二氫乙啶，被活細(xì)胞攝入后，可在細(xì)胞內(nèi)的ROS作用下脫氫，產(chǎn)生溴化乙錠。溴化乙錠可以和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平較高時(shí)，產(chǎn)生的溴化乙錠較多，紅色熒光就較強(qiáng)，表示細(xì)胞氧化損傷較大，反之則較弱。利用熒光顯微鏡觀(guān)察活細(xì)胞中紅色熒光可以判斷細(xì)胞內(nèi)ROS生成的多少。利用ROS熒光檢測(cè)探針DHE觀(guān)察暴露于濃度為5 mg·L-1、40 mg·L-1的MC-LR 24 h后，S.pombe細(xì)胞、HepG2和U87細(xì)胞內(nèi)ROS的變化趨勢(shì)結(jié)果見(jiàn)圖4。

表5 MC-LR對(duì)S. pombe細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞的DNA損傷Table 5 DNA damage induced by MC-LR on S. pombe, HepG2 and U87

圖4 S.pombe、HepG2及U87細(xì)胞經(jīng)MC暴露24 h后的ROS表征Fig. 4 ROS characterization in S.pombe, HepG2 and U87 treated with MC-LR after 24 h

MC-LR處理24 h后，S.pombe細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，ROS水平增加，但不同劑量的MC暴露對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度影響不顯著；HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，且高劑量暴露細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于低劑量MC暴露細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS量隨MC劑量增加而增大，MC對(duì)HepG2細(xì)胞的損害隨劑量增加而增大；低劑量暴露的U87細(xì)胞內(nèi)熒光面積大于對(duì)照組，高劑量暴露的U87細(xì)胞內(nèi)熒光面積更為集中，熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，可見(jiàn)MC對(duì)U87細(xì)胞DNA的損害作用顯著。

3種細(xì)胞內(nèi)ROS均高于空白對(duì)照，隨著暴露劑量增加，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，具有一定的劑量響應(yīng)關(guān)系。其中HepG2細(xì)胞與U87細(xì)胞對(duì)MC誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS較S.pombe細(xì)胞敏感。

2.3 MC-LR對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化自由基的誘導(dǎo)

自由氧化劑是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的具有強(qiáng)氧化性，可損傷機(jī)體組織和細(xì)胞，引起慢性疾病和衰老的有害化合物。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)缺失spc1△、atf1△、pmk1△、wis1△和pap1△的S.pombe細(xì)胞暴露在MC-LR下的增殖率以觀(guān)察MC-LR誘導(dǎo)S.pombe細(xì)胞中生成ROS過(guò)程中是否涉及蛋白激酶或者氧化應(yīng)激響。

5 mg·L-1與40 mg·L-1的MC-LR作用于S.pombe細(xì)胞及其缺失性突變體24 h后的細(xì)胞增殖率如圖5所示。

圖5 缺失型S.pombe突變體細(xì)胞經(jīng)MC-LR暴露后的增殖率(p＜0.05)Fig. 5 Cell viability of S.pombe treated with different sizes of MC-LR compared with the control group (p＜0.05)

在40 mg·L-1MC暴露24 h下，野生型S.pombe、缺失型spc1△、atf1△、pmk1△、wis1△和pap1△的細(xì)胞增殖率均受到顯著性抑制（p＜0.05），分別為未暴露環(huán)境下S.pombe細(xì)胞的80.4%、78.2%、81.3%、78.8%、92.7%、92.3%。其中，缺失型wis1△和pap1△的細(xì)胞增殖率差異較少，說(shuō)明S. pombe缺失型wis1△和pap1△較野生型及其他S. pombe缺失型對(duì)MC-LR的耐受性更強(qiáng)，而S.pombe缺失型spc1△和pmk1△較野生型及其他S.pombe缺失型對(duì)MC-LR更為敏感。

經(jīng)DHE染色的結(jié)果見(jiàn)圖6。

野生型和缺失型spc1△、atf1△、pmk1△的ROS熒光水平均有明顯差異，表明細(xì)胞受到氧化損傷。同時(shí)，在MC-LR暴露下，wis1△和pap1△的ROS熒光水平并不明顯。與生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討論

3.1 MC-LR對(duì)3種細(xì)胞的損傷作用

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)觀(guān)察暴露在MC-LR的S.pombe細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞的損傷。經(jīng)MC-LR暴露后，40 mg·L-1組較空白對(duì)照DNA的尾長(zhǎng)、尾矩以及Oliver尾矩，S.pombe細(xì)胞分別增加11.7像素，1.14像素和1.07像素；HepG2細(xì)胞分別增加52.6像素，9.07像素及8.62像素；U87細(xì)胞分別增加60.5像素，10.65像素及9.50像素。其中，S.pombe細(xì)胞的尾長(zhǎng)變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS增量較其他指標(biāo)敏感。HepG2細(xì)胞和U87胞的DNA損傷程度較S.pombe細(xì)胞顯著，主要體現(xiàn)在在尾距和Olive尾距的顯著增值。經(jīng)過(guò)濃度為40 mg·L-1的MC-LR暴露處理后的S.pombe細(xì)胞尾距、Olive尾距分別是空白組的19.5倍、19.7倍，低劑量暴露組的4.2倍、4.3倍；U87細(xì)胞尾距、Olive尾距分別是空白組的21.1倍、22.1倍，低劑量暴露組的4.1倍、4.2倍?？梢?jiàn)彗星實(shí)驗(yàn)中的尾距和Olive尾距2項(xiàng)指標(biāo)可以較為敏感的指示細(xì)胞中DNA，并能明顯表達(dá)MC損害與劑量的關(guān)系，隨MC暴露劑量的增加細(xì)胞損傷更嚴(yán)重。

圖6 S.pombe突變體經(jīng)MC-LR暴露后的ROS表征Fig. 6 ROS characterization of S.pombe mutants incubated with MC-LR after 24 h

3.2 MC造成細(xì)胞損傷的途徑

經(jīng)MC-LR處理的3種細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ROS增加，說(shuō)明MC可以誘導(dǎo)ROS生成。暴露于MC-LR的細(xì)胞內(nèi)都有大量氧化自由基，可以認(rèn)為MC-LR是通過(guò)氧化路徑誘導(dǎo)DNA損傷的。HepG2較S.pombe細(xì)胞與U87細(xì)胞對(duì)MC誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS敏感。Yan2012年關(guān)于MC-LR對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞的研究結(jié)論表明，暴露在MC-LR環(huán)境下能增加大鼠睪丸支持細(xì)胞內(nèi)ROS，直接導(dǎo)致大鼠的生殖毒性（Li和Han，2012）。Ding和Ong（2003）研究活體小鼠在暴露于MC后，肝組織細(xì)胞的變化，結(jié)果顯示，小鼠肝細(xì)胞內(nèi)有ROS生成，并引發(fā)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)化（MPT），最終導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。可見(jiàn)，HepG2細(xì)胞是研究MC誘導(dǎo)ROS能力的理想模式細(xì)胞。而進(jìn)一步研究U87細(xì)胞對(duì)MC誘導(dǎo)ROS的敏感性，可以深入研究U87在研究MC毒效的適用性，并深入MC對(duì)人體健康的威脅，明確其對(duì)人體神經(jīng)組織的毒害效果，因此U87細(xì)胞也適用于研究MC誘導(dǎo)ROS的能力。

3.3 MC-LR誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化自由基路徑初探

大量研究證實(shí)，當(dāng)S. pombe受到外界環(huán)境的氧化壓力時(shí)，為響應(yīng)環(huán)境壓力，細(xì)胞會(huì)激活細(xì)胞中2種主要的氧化應(yīng)激響應(yīng)途徑來(lái)調(diào)控分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）。S. pombe主要有2種涉及氧化應(yīng)激調(diào)控的促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK），包括與人類(lèi)MAPK p38具有同源性的Spc1與為細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）相關(guān)的Pmk1，其編碼基因分別為參與Sty1p-Atf1p MAP激酶路徑spc1（又稱(chēng)sty1或phh1）和參與Mkh1p-Pek1p-Spm1p MAP激酶路徑pmk1（又稱(chēng)spm1）（Wang，Gulis，Buckner等，2010）。atf1基因是編碼蛋白Spc1/Sty1的轉(zhuǎn)錄因子，參與氧化應(yīng)激響應(yīng)中的Sty1p-Atf1p MAP激酶路徑（Lawrence，Caroline，Wilkinson，2009）；pap1基因是通過(guò)由半胱氨酸殘基修飾細(xì)胞核定位因子來(lái)激活的轉(zhuǎn)錄因子（Mutoh，Nakagawa，Ando，1991），參與細(xì)胞Sty1p-Atf1p MAP激酶路徑的調(diào)控；wis1基因能編碼絲裂原活化蛋白激酶Spc1激酶MAPKK，在細(xì)胞的環(huán)境壓力響應(yīng)中常被激活。DHE染色結(jié)果顯示缺失型spc1△、pmk1△的ROS熒光水平差異最明顯。同時(shí)，在MC-LR暴露下，wis1△和pap1△的ROS熒光水平并不明顯。MC暴露下，基因缺失型細(xì)胞wis1△和pap1△的生長(zhǎng)率高于野生型S. pombe，且ROS水平明顯下降。與生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。可以認(rèn)為MC-LR對(duì)缺失wis1△和pap1△基因的S.pombe細(xì)胞毒性較弱，無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化自由基，這也進(jìn)一步說(shuō)明了氧化損傷是MC損傷S.pombe的主要方式。因此，wis1△和pap1△路徑極可能是MC-LR誘導(dǎo)S.pombe細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的路徑。

3.4 水體中MC生物毒性的模式細(xì)胞的挑選

從對(duì)細(xì)胞角度活性角度看，S. pombe細(xì)胞經(jīng)暴露8 h內(nèi)，生長(zhǎng)情況一致，8 h后各濃度MC-LR對(duì)其生長(zhǎng)抑制情況產(chǎn)生分化。從細(xì)胞活性的角度來(lái)看，S.pombe細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)MC比較敏感，適合作為研究MC細(xì)胞毒性的模式細(xì)胞。MC-LR暴露72 h后的HepG2細(xì)胞，各濃度處理的死亡細(xì)胞均較少，且MC-LR濃度越高，HepG2的最終細(xì)胞數(shù)越多。這與施瑋（2002）以原代肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的研究結(jié)果相似，施瑋認(rèn)為HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)加快的原因極可能是因?yàn)镸C-LR促進(jìn)了細(xì)胞的去分化，使細(xì)胞提前啟動(dòng)進(jìn)入增殖階段。MC-LR能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增值，因此HepG2細(xì)胞不適于以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)為指標(biāo)的MC毒害作用研究。MC-LR能抑制U87細(xì)胞增值同時(shí)誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡，0～24時(shí)變化最為明顯。處理U87細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率隨MC濃度增加而增加，有一定的劑量關(guān)系，U87細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)MC敏感，適合作為研究MC細(xì)胞毒性的模式細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)的最佳暴露時(shí)間為24 h。

由于S.pombe細(xì)胞的細(xì)胞壁對(duì)EB染料進(jìn)入細(xì)胞有阻礙作用，在熒光條件下難以觀(guān)察到DNA，經(jīng)單細(xì)胞凝膠電泳后，S.pombe細(xì)胞的DNA熒光信號(hào)極弱，每1000個(gè)細(xì)胞只有將近20個(gè)有熒光反應(yīng)。雖然實(shí)驗(yàn)中有去除細(xì)胞壁的過(guò)程，但現(xiàn)有技術(shù)難以有效反映S.pombe細(xì)胞DNA受損的真實(shí)情況。另外，S.pombe細(xì)胞的DNA量較小，這也使它的彗星拖尾難以觀(guān)察。因此S.pombe細(xì)胞不適于研究MC損傷DNA的能力。而HepG2細(xì)胞和U87細(xì)胞的DNA對(duì)MC十分敏感，低劑量的暴露條件下也呈現(xiàn)出較為明顯的彗星現(xiàn)象。隨著暴露劑量的提高，彗星現(xiàn)象也越為明顯，4項(xiàng)表征DNA受損程度的指標(biāo)都表現(xiàn)出劑量反應(yīng)關(guān)系，其中尾距和Olive尾距兩項(xiàng)指標(biāo)更為顯著。因此，利用HepG2細(xì)胞與U87的彗星實(shí)驗(yàn)，可能是理想的評(píng)估水體中MC生物毒性的模式細(xì)胞。

4 實(shí)驗(yàn)主要結(jié)論

（1）MC通過(guò)誘導(dǎo)ROS生成導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

（2）MC-LR誘導(dǎo)S.pombe細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的路徑極可能是wis1△和pap1△路徑。

（3）HepG2細(xì)胞與U87細(xì)胞適合作為水體中MC生物毒性評(píng)估的模式細(xì)胞。

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Toxic Effects of Two Kinds of Microcystin to Fungus and Mammalian Cells

CHEN Huiyuan2, ZHANG ZhiHao2, HUANG Yi1,2

1. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China; 2. Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China

s: To research the toxic effect of microcystin exerting to fungus and mammalian cells, and to explore the potential model cell for biological toxicity assessment of eutrophication water body, several biological indicators are defined in this study to test the influence of MC on DNA damage and oxyradical concentrations including S.pombe cells, HepG2 cells and U87 cells by toxicity tests and single cell gel electrophoresis. Moreover, application of genetically depleted S.pombe is efficient for determining the oxidative stress path induced by MC in/between yeast cells. Through the observation, we can see DNA damage by MC-LR was supposed to happen in oxidative path. The experiment shows that S.pombe cells without gene wis1△ and pap1△ can not induce ROS. Treated with 40 mg·L-1MC for 24 h, the growth rate of gene wis1△ and pap1△ deletion mutant merely decline by 7.3%, 7.7%. Oxidative injury is the main MC damage exerting to S.pome cells. The HepG2 cells and U87 cells were more suitable for risk assessment than S.pombe cells.

microcystin; S.pombe; HepG2; U87; cytotoxicity; gene damage

X17

A

1674-5906（2014）10-1650-07

陳惠苑，張郅灝，黃藝. 微囊藻毒素對(duì)真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒害效應(yīng)的研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2014, 23(10): 1650-1656.

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國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX07501002-006)

陳惠苑（1991年生），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗廴局卫?。E-mail：chhyuan@pku.edu.cn

2014-06-10