蔣在雄

（長(zhǎng)江大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434100）

蒜，為一年生或二年生草本植物，味辛辣，以其鱗莖、蒜薹、幼株供食用。 大蒜中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物。 黃酮類(lèi)化合物是一組存在于植物中的天然產(chǎn)物，在自然界中分布廣泛，屬于植物次級(jí)代謝產(chǎn)物。在植物中少部分以游離形式存在，大部分與蔗糖合成苷類(lèi)以配基的形式存在[1-2]。 近年來(lái)，人們對(duì)黃酮化合物的利用也越來(lái)越重視，其在食品、醫(yī)藥、保健品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣闊前景[3-5]。 微波輔助萃取法具有提取時(shí)間短，萃取所得產(chǎn)品雜質(zhì)含量低、有效成分高等優(yōu)點(diǎn)，微波萃取法已用于很多植物的研究，它的萃取速度和萃取產(chǎn)物的質(zhì)量使得該技術(shù)成為天然產(chǎn)物提取的有力工具。而將微波技術(shù)用于大蒜中總黃酮的提取尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑提取大蒜中黃酮類(lèi)化合物，采用分光光度法[3]測(cè)定總黃酮含量，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了微波法提取大蒜中總黃酮的條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料：大蒜購(gòu)買(mǎi)于荊州市美廉美超市。

1.1.2 主要試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，蘆丁含量≥98%；水乙醇，丙酮，甲醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，等輔助試劑均為市售，分析純。

1.1.3 主要儀器：BS-124S 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)， 購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司；XCA-8000I 電熱鼓風(fēng)干燥箱， 購(gòu)自天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SP-2100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)， 購(gòu)自上海光譜儀有限公司；MAS-1 常壓微波輔助合成∕萃取反應(yīng)儀， 購(gòu)自上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；BS-124S 電子天平，購(gòu)自塞多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理。將大蒜剝皮后清洗干凈，然后均勻切片，放入燒杯中，然后將燒杯置于80℃水浴鍋中恒溫加熱5 min，等瀝干水分置于60℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干， 取出后用中萬(wàn)能粉碎機(jī)將其粉碎，最后放在試劑瓶中密封保存，備用。

1.2.2 篩選提取溶劑。 準(zhǔn)確稱(chēng)取2g 大蒜干粉分別用丙酮、無(wú)水乙醇、甲醇為溶劑， 以物料比 1：30， 在功率 400W， 溫度 70℃下回流提取20min 后抽慮， 然后將提取物用相應(yīng)的溶劑定容至100ml 的容量瓶中，分別測(cè)定不同溶劑提取液中的總黃酮含量。 采用本試驗(yàn)中最適合于大蒜黃酮提取的溶劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 微波法提取大蒜中總黃酮的單因素試驗(yàn)。 考察微波時(shí)間、溶劑濃度、微波功率、加熱溫度等因素對(duì)大蒜中總黃酮提取量的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)來(lái)確定最佳的提取條件。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)。 綜合微波法單因素試驗(yàn)，選用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以提取液中總黃酮的含量高低為考察指標(biāo)，確定大蒜干粉中總黃酮提取的最佳條件。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸。得蘆丁濃度與吸光度的回歸方程為：y=10.833x-0.0016, 相關(guān)系數(shù)是 R2=0.9992，表明本方法線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 微波提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 微波提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

選擇適宜的微波時(shí)間。 確稱(chēng)取2g 大蒜干粉，用80%乙醇以物料比1：30，在功率 400W，溫度 70℃下分別回流提取 1min、2min、3min、4min、5min、7min、10min、12min、15min、17min、20min、25min 后抽慮，將提取物定容至100mL，作為待測(cè)液，分別測(cè)定不同時(shí)間提取液中的總黃酮含量。

圖2 微波提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2 以看出， 總黃酮的提取量總體上隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在12min 時(shí)提取量最大，時(shí)間再延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。 這可能是由于微波時(shí)間太長(zhǎng)引起溫度升高造成乙醇揮發(fā)，以及微波對(duì)總黃酮結(jié)構(gòu)破壞造成損失導(dǎo)致的，并且因?yàn)辄S酮類(lèi)物質(zhì)在高溫下不穩(wěn)定，長(zhǎng)期使其處于高溫狀態(tài)易導(dǎo)致其氧化，使得率反而下降。 故以12min 為適宜微波時(shí)間。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響

選擇適宜的乙醇濃度。 準(zhǔn)確稱(chēng)取2g 大蒜干粉，分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇以物料比1：30，在功率400W，溫度70℃下回流提取12min 后抽慮，將提取物定容至100mL，作為待測(cè)液，分別測(cè)定不同濃度提取液中的總黃酮含量。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇和大蒜干粉的溶解效果不是很好，萃取之后成為懸浮液，過(guò)濾效果不好且時(shí)間漫長(zhǎng)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 經(jīng)過(guò)分析可能是：大蒜是一種高分子聚合物，濃度太低時(shí)，乙醇和黃酮類(lèi)物質(zhì)之間的溶解度很小導(dǎo)致萃取出的其它雜質(zhì)很多影響過(guò)濾；太高時(shí)，可能是乙醇使其它脂溶性等物質(zhì)的溶出量也增多， 導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物的溶解量減少而萃取之后懸浮物很多影響過(guò)濾進(jìn)而影響吸光度。 最后把實(shí)驗(yàn)范圍定在75%～85%之間選取最之間選取最佳值，由圖3 知，75%的乙醇濃度是最佳濃度。

2.2.3 微波功率對(duì)總黃酮提取的影響

選擇適宜的微波功率。 準(zhǔn)確稱(chēng)取2g 大蒜干粉，用75%乙醇以物料比 1：30， 分別在功率 100W、200W、300W、400W、500W、600 W、700 W、800W、900W， 溫度70℃下回流提取12min 后抽慮， 將提取物定容至100mL，作為待測(cè)液，分別測(cè)定不同功率提取液中的總黃酮含量。

圖4 微波功率對(duì)總黃酮提取的影響

由圖4 可知，在500W 時(shí)提取率最大，隨后總體呈下降趨勢(shì)，可能是由于功率越高對(duì)黃酮結(jié)構(gòu)破壞性越大，反而不利于黃酮提取。 功率越高升溫越快，由于提取溫度固定在70℃，故功率在自動(dòng)不斷調(diào)整以保持恒溫，而500 W 以上已足以很快達(dá)到70℃，隨后功率會(huì)自動(dòng)變小以防溫度過(guò)高，并且減少了對(duì)黃酮的破環(huán)，從而出現(xiàn)提取率隨一個(gè)值上下波動(dòng)的情況。 故選擇微波功率500W 繼續(xù)后面的實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 加熱溫度對(duì)總黃酮提取的影響

選擇適宜的提取溫度。準(zhǔn)確稱(chēng)取2g 大蒜干粉，用75%乙醇以物料比 1：30，在功率 500 W，溫度為 50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下分別回流提取12min 后抽慮，將提取物定容至100mL，作為待測(cè)液，分別測(cè)定不同溫度下提取液中的總黃酮含量。

圖5 加熱溫度對(duì)總黃酮提取的影響

由圖5 可知，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率隨加熱溫度的升高先升高后下降。當(dāng)溫度升到70℃時(shí)黃酮提取率最大。 一般來(lái)說(shuō)，在高溫下提取效率高，因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快，使黃酮類(lèi)物質(zhì)更易從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到溶劑中。但溫度高于70℃以后，伴隨著溫度的升高，一些大分子物質(zhì)溶出，其生物活性成分可能還要遭到破壞，黃酮類(lèi)化合物的提取率會(huì)下降。 故以70℃為最佳提取溫度。

2.3 微波法取的正交實(shí)驗(yàn)

由表2 可知， 其中以試驗(yàn)號(hào)1 所得的提取液中總黃酮的含量最高，即A1B2C2D3為較好的工藝。 從極差R 值的大小可以看出：因素A乙醇濃度對(duì)總黃酮含量影響最大，因素B 即溫度對(duì)總黃酮含量影響最小。因此，對(duì)提取液中總黃酮含量影響的大小順序依次為A-乙醇濃度(%)＞C-微波時(shí)間 (min)＞D-微波功率（W）＞B-加熱溫度 (℃)。 從水平效應(yīng)均值計(jì)算結(jié)果可以得出，A1B2C2D3為最佳提取條件。 但A1B2C2D3不包括在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表內(nèi)，因此通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證明該條件下所得的總黃酮含量是否比試驗(yàn)號(hào)1 更高。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取2g 大蒜干粉，用85%乙醇在功率600W，溫度70℃下，以1：30 的物料比回流提取12min 后抽濾，將提取物定容至100mL，作為待測(cè)液，測(cè)定提取液中的總黃酮含量。 結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按此條件黃酮提取率e 比正交試驗(yàn)號(hào)1 提高了0.0238%，方法可行。

3 結(jié)論

微波輔助提取總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度85%，加熱溫度70℃，微波時(shí)間12min，微波功率600W。 采用微波輔助提取天然產(chǎn)物中的活性物質(zhì)，具有提取效率高、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、縮短時(shí)間、節(jié)約溶劑、降低能耗、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，微波輔助提取大蒜中的總黃酮應(yīng)可用于實(shí)踐。

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