董國文，吳鐘海，張麗華，王仁章

（三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院,福建 三明 365004）

生物合成Cr2O3納米顆粒

董國文，吳鐘海，張麗華，王仁章

（三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院,福建 三明 365004）

微生物還原固定鉻對Cr(VI)污染環(huán)境修復(fù)具有重要意義。篩選獲得一株Cr(VI)還原菌株XMCr-6，并對其生物還原固定Cr(VI)進(jìn)行了研究。動力學(xué)實驗顯示Cr(VI)是先還原，然后吸附固定在細(xì)胞表面。XPS分析表明鉻在細(xì)胞表面主要是以三價的形式存在，高分辨透射電鏡結(jié)合能譜分析進(jìn)一步證實是形成Cr2O3納米顆粒。

Cr(VI)；生物修復(fù)；納米Cr2O3；廢水處理

在工業(yè)化進(jìn)程加快的今天，環(huán)境問題日益凸顯，特別是重金屬鉻污染問題越發(fā)嚴(yán)重。2012年“毒膠囊事件”使得鉻污染及其對人體的危害再度成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。鉻污染主要是指由Cr (VI)所引起的污染。具有毒性的Cr(VI)污染物不僅對環(huán)境、牲畜有毒害作用，對人體也有“三致”作用[1]，其毒性約是Cr(III)的100倍[2]。把Cr(VI)還原成Cr(III)，不僅是一種有效的解毒方式，而且也是從水環(huán)境中去除鉻的關(guān)鍵步驟。已有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中部分微生物能夠在有氧或厭氧的條件下將 Cr(VI)還原成 Cr(III)[3-4]，說明微生物在修復(fù)Cr(VI)污染的水體具有巨大的潛力。傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法如還原沉淀、離子交換和反滲透用來處理Cr(VI)的污染使其達(dá)標(biāo)排放，意味著高運(yùn)行成本，尋求一種高效便捷的鉻污染治理方法顯得尤為重要。

1 實驗材料與方法

1.1 材料和試劑

菌株XMCr-6(本實驗室保存)，重鉻酸鉀(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，二苯基碳酰二肼(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，丙酮(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，酵母粉(BR，OXOID)，胰蛋白胨(BR，國藥集團(tuán)化學(xué)上海化學(xué)試劑公司)。LB培養(yǎng)基：10 g·L-1胰蛋白胨，5.0 g·L-1酵母提取物和 5.0 g·L-1氯化鈉。

1.2 微生物還原Cr(VI)

菌株XMCr-6過夜培養(yǎng)，然后在4°C低溫條件下離心獲得完整細(xì)胞，完整細(xì)胞用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS,0.2 mol·L-1，pH=7.0)清洗3次，并重新懸浮，最終濃度為0.1 g·mL-1(濕重)。加入Cr(VI)并使終濃度為100 mg·L-1。還原反應(yīng)在離心管中進(jìn)行，28°C條件下連續(xù)震蕩12 h(150 r·min-1)。細(xì)胞用PBS清洗3次，冷凍并低溫(-50°C)干燥(EYELA FD-1000,Japan)。

1.3 胞外Cr2O3納米顆粒的表征

冷凍干燥樣品用于光電子能譜XPS分析(PHI,QUANTUM 2000,USA)。用于透射電鏡(TEM)的樣品用PBS清洗后用2.5%戊二醛在4°C固定2 h后，用移液器吸取5 μL溶液點(diǎn)滴到銅網(wǎng)的碳膜上，放置2 h用于TEM-EDX(Tecnai F30)表征。

1.4 測試方法

總鉻采用AAS測試 (TAS-986，北京普析通用)，Cr(VI)采用1,5二苯卡巴肼分光光度法測試(TU1900，北京普析)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同生長條件對菌株XMCr-6還原Cr(VI)的影響

經(jīng)過對菌株XMCr-6進(jìn)行馴化，能夠在48 h內(nèi)還原100 mg·L-1的Cr(VI)，同時考察了不同溫度、pH和Cr(VI)初始濃度對其還原Cr(VI)的效果，結(jié)果見圖1～3。

圖1溫度對菌株XMCr-6還原Cr(VI)的影響

圖2 pH對菌株XMCr-6還原Cr(VI)的影響

分別考察了菌株XMCr-6在溫度為22，28，37°C條件下對Cr(VI)的還原情況，發(fā)現(xiàn)菌株XMCr-6 在3種溫度條件下分別能還原46%，91%和97%的Cr(VI)(100 mg·L-1)。還原能力在溫度為28和37之間差距較小，溫度在22°C時還原能力有明顯抑制。菌株XMCr-6在很廣泛的pH(5～9)范圍內(nèi)能還原Cr(VI)，最大的還原率出現(xiàn)在pH=8～9，但pH=5時，Cr(VI)的還原幾乎停止。還考察了不同Cr(VI)濃度對菌株XMCr-6還原能力的影響，發(fā)現(xiàn)菌株XMCr-6在36和48 h內(nèi)能分別完全還原50和100 mg·L-1Cr(VI)。在Cr(VI)濃度為150和200 mg·L-1時，菌株XMCr-6在84 h內(nèi)分別能還原94%和70% 的Cr(VI)。

2.2 生物吸附還原機(jī)制

微生物還原Cr(VI)的機(jī)制有多種，還原過程也比較復(fù)雜，為了弄清楚菌株XMCr-6還原Cr(VI)的機(jī)制，做了菌體還原Cr(VI)的動力學(xué)實驗。從圖4中可知，Cr(VI)在pH=7的情況下沒有吸附到細(xì)胞上。然而，當(dāng)pH調(diào)到2時，立刻有大量(73%)的Cr(VI)被吸附到細(xì)胞上。先前生長條件實驗中細(xì)胞均在pH=7的條件下還原Cr(VI)。并且已有報道酶促反應(yīng)引起的Cr(VI)還原是在pH=7.0～7.5的條件下發(fā)生的，而非生物還原是在較低pH條件下(pH=2.0～3.0)[5]。這是由于Cr(VI)陰離子是帶負(fù)電荷，在低pH條件下有利于吸附到細(xì)胞或者其他生物分子上。與此同時，動力學(xué)實驗結(jié)果顯示Cr(VI)的還原和Cr(III)的固定不是同步的(表1)，還原反應(yīng)3 h時，有40.4%的Cr(VI)被還原，然而只有71.4%的Cr (III)被固定。從3 h到15 h，Cr(III)的固定從71.4%上升到95.6%，說明Cr(VI)的還原要快于Cr(III)的固定。由此說明是Cr(VI)先還原，然后還原的Cr(III)與細(xì)胞吸附并被固定在細(xì)胞表面。

圖3 Cr(VI)濃度對菌株XMCr-6還原Cr(VI)的影響

圖 4 pH值對Cr(VI)吸附的影響

表1 不同時間鉻的還原率和固定率

2.3 細(xì)胞表面納米Cr2O3顆粒表征

Cr(VI)還原后細(xì)胞上鉻的可能化學(xué)價態(tài)通過XPS來分析(圖5)，數(shù)據(jù)顯示細(xì)胞表面的鉻有兩個明顯的峰值：586.5 eV(Cr 2p1/2)和 577.8 eV(Cr 2p3/2)，而標(biāo)準(zhǔn)的Cr2O3的峰為：Cr 2p1/2 586.0 eV 和 Cr 2p3/2 576.2 eV[6]。與標(biāo)準(zhǔn)的Cr2O3的峰值比較，證實細(xì)胞表面的鉻是Cr(III)。通過TEM觀察細(xì)胞表面，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞表面及細(xì)胞與細(xì)胞之間存在大量粒徑在4 nm的顆粒(圖6a)，隨后的EDX能譜顯示這些沉積物包含鉻(圖6)。這些沉淀物主要是球形的和少量無定型的納米顆粒。此外，高分辨透射電鏡(HRTEM)已經(jīng)有用來表征Cr(III)的納米顆粒[7]，本實驗中用HRTEM來表征納米顆粒(圖6b)，結(jié)果顯示晶格間距是0.246 nm，這是Cr2O3的110面[8]。結(jié)合XPS的結(jié)果，可以證實形成的是Cr2O3納米顆粒。

以前研究結(jié)果中很少有通過微生物還原形成球形的Cr2O3納米顆粒。本研究中，Cr2O3納米顆粒被菌株XMCr-6生物合成，主要是沉淀在細(xì)胞表面。Cheung報道了其他一些不同的觀察結(jié)果，鉻的聚集物存在于Bacillus megaterium TKW3的細(xì)胞膜內(nèi)[9]，而Daulton應(yīng)用TEM-EDX發(fā)現(xiàn)密集的聚合物沉淀在整個細(xì)胞表面[10]。

圖5 細(xì)胞表面納米顆粒XPS表征

圖6 細(xì)胞外納米顆粒的TEM-EDX和HRTEM表征

3 結(jié)論

自然界中許多菌種具有Cr(VI)還原能力，因而用微生物法治理鉻污染已受到人們的廣泛認(rèn)可。然而，大部分報道都集中在Cr(VI)的還原過程而很少關(guān)注形成Cr(III)的最終產(chǎn)物[11-12]，其實Cr(III)的最終產(chǎn)物才決定鉻的生物有效性。微生物還原Cr(VI)的最終產(chǎn)物一般包括可溶和不溶的Cr(III)[13]。如有些微生物能夠?qū)r(VI)還原為不溶的氫氧化物[9,14]、與有機(jī)配體形成可溶的有機(jī)-Cr(III)復(fù)合物[15]。Cr(III)的有機(jī)復(fù)合物或沉淀物對細(xì)胞的損傷是最小的[16]，這可能是微生物為了保護(hù)自己而進(jìn)行的一種解毒機(jī)制。本實驗對菌株XMCr-6還原解毒Cr(VI)的特性和機(jī)理進(jìn)行了研究與探討，發(fā)現(xiàn)菌株XMCr-6能夠在很寬的溫度(22～37℃)和pH(6～9)范圍內(nèi)生長，48h內(nèi)能完全還原100 mg·L-1的Cr(VI)；菌株XMCr-6還原Cr(VI)的機(jī)制是先還原Cr(VI)，逐步吸附沉淀到細(xì)胞上，最終形成Cr2O3納米顆粒。微生物將Cr(VI)轉(zhuǎn)化為Cr(III)的沉淀物而去除，被認(rèn)為是生物解毒的一種機(jī)制，也是Cr(VI)污染物去除的一種徹底解決含鉻有毒物的環(huán)保新技術(shù)，其結(jié)論可為含鉻廢水、廢渣生物處理提供理論依據(jù)。

［1］ZHITKOVICH A．Chromiumindrinkingwater：sources，metabolism，andcancerrisks［J］．ChemicalResearchin Toxicology，2011，24（10）：1617－1629．

［2］CHEUNG K H，GU J D．Mechanism of hexavalent chromium detoxification by microorganisms and bioremediation application potential：a review［J］．International Biodeterioration＆Biodegradation，2007，59（1）：8－15．

［3］ZHAO C Q，YANG Q H，CHEN W Y，et al．Removal of hexavalent chromium in tannery wastewater by Bacillus cereus ［J］．Canadian Journal of Microbiology，2012，58（1）：23－28．

［4］THACKER U，PARIKH R，SHOUCHE Y，et al．Reduction of chromate by cell－free extract of Brucella sp isolated from Cr（VI）contaminated sites［J］．Bioresource Technology，2007，98（8）：1541－1547．

［5］DAS S K，GUHA A K．Biosorption of hexavalent chromium by Termitomyces clypeatus biomass：kinetics and transmission electron microscopic study［J］．Journal of Hazardous Materials，2009，167（1）：685－691．

［6］MANNING B A，KISER J R，KWON H，et al．Spectroscopic investigation of Cr（III）－and Cr（VI）－treated nanoscale zerovalent iron［J］．Environmental Science＆Technology，2007，41（2）：586－592．

［7］DAS S K，SHOME I，GUHA A K．Surface functionalization of Aspergillus versicolor mycelia：in situ fabrication of cadmium sulphidenanoparticles and removal of cadmium ions from aqueous solution［J］．RSC Advances，2012，2（7）：3000－3007．

［8］PANDA N R，ACHARYA B S，NAYAK P，et al．Role of Cr3＋ions on superexchange coupling in alpha－Fe2O3nanoparticles［J］．Physica B－Condensed Matter，2012，407（14）：2716－2720．

［9］CHEUNG K H，LA H YI，GU J D．Membrane－associated hexavalent chromium reductase of Bacillus megatelium TKW3 with induced expression［J］．Journal of Microbiology and Biotechnology，2006，16（6）：855－862．

［10］DAULTON T L，LITTLE B J，LOWE K，et al．Electron energy loss spectroscopy techniques for the study of microbial chromium（VI）reduction［J］．Journal of Microbiological Methods，2002，50（1）：39－54．

［11］DAS S K，MUKHERJEE M，GUHA A K．Interaction of chromium with resistant strain Aspergillus versicolor：investigation with atomic force microscopy and other physical studies［J］．Langmuir，2008，24（16）：8643－8650．

［12］PARK D，YUN Y S，HYE JO J，et al．Mechanism of hexavalent chromium removal by dead fungal biomass of Aspergillus niger［J］．Water Research，2005，39（4）：533－540．

［13］CHENG Y J，YAN F B，HUANG F，et al．Bioremediation of Cr（VI）and Immobilization as Cr（III）by Ochrobactrum anthropi［J］．Environmental Science＆Technology，2010，44（16）：6357－6363．

［14］LI B，PAN D M，ZHENG J S，et al．Microscopic investigations of the Cr（VI）uptake mechanism of living Ochrobactrum anthropi［J］．Langmuir，2008，24（17）：9630－9635．

［15］PUZON G J，ROBERTS A G，KRAMER D M，et al．Formation of soluble organo－chromium（III）complexes after chromate reduction in the presence of cellular organics［J］．Environmental Science＆Technology，2005，39（8）：2811－2817．

［16］BENCHEIKH－LATMANI R，OBRAZTSOVA A，MACKEY M R，et al．Toxicity of Cr（III）to Shewanella sp strain MR－4 during Cr（VI）reduction［J］．Environmental Science＆Technology，2007，41（1）：214－220．

(責(zé)任編輯：朱聯(lián)九）

Biosynthesis of Cr2O3Nanoparticles by Strain XMCr-6

DONG Guo-wen,WU Zhong-hai,ZHANG Li-hua,WANG Ren-zhang

(College of Resource and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

A basic understanding related to the immobilization of chromium by bacteria is essential for chromate pollutant remediation in the environment.In this work,the Cr(VI)-immobilization process by strain XMCr-6 was studied. The kinetics experiment result showed that Cr(VI)reduction and Cr(III)immobilization happened asynchronously,the binding sequence of Cr(III)on the cell surface was bound after reduction.X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)analysis revealed that the chromium accumulated on bacteria were mostly in Cr(III)states.Scanning electron microscopy (SEM)observations showed that noticeable Cr(Ill)precipitates were accumulated on bacterial surfaces.HRTEM image coupled with energy-dispersive X-ray spectroscopy showed that the Cr2O3nanoparticles were obtained during the Cr(VI) reduction process.

Cr(VI);Bioremediation;Cr2O3Nanoparticles;waste treatment.

X172

A

1673-4343（2014）04-0001-05

10．14098／j．cn35－1288／z．2014．04．001

2013-12-08

國家自然科學(xué)基金（41301346）；福建省科技廳重點(diǎn)項目（2012Y0061）；福建省大學(xué)生創(chuàng)新計劃項目（ZL1125／CS）；2011潔凈煤氣化技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心項目

董國文，男，安徽宿松人，博士，講師。研究方向：污染環(huán)境生物修復(fù)。