代 鵬，何 丹，王 晉，欒 靜，孫 玉 梅

（1.大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會，北京 100833）

0 引 言

微生物混合發(fā)酵技術(shù)在污染物降解、燃料乙醇、食品和氨基酸工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛應用［1］。利用酵母菌與醋酸菌在適當條件下可以互利共生，通過酒精和醋酸同步發(fā)酵進行混菌發(fā)酵釀造果醋［2］。國外已有將酒精與醋酸混合發(fā)酵生產(chǎn)食醋的研究報道［3－4］。與傳統(tǒng)兩步發(fā)酵相比，混合發(fā)酵不僅能夠避免中間產(chǎn)物過量積累對菌體的影響，而且還能簡化工藝設(shè)備、降低能耗和縮短發(fā)酵周期［5］，對進一步提高果醋生產(chǎn)效率具有很高的應用價值。

本實驗選用一株從草莓自然發(fā)酵醪中分離的降糖、產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力均較釀酒酵母強的裂殖酵母菌株［6］，在蘋果汁酒精發(fā)酵的不同時期接入一定量的醋酸菌，監(jiān)測發(fā)酵過程中2種微生物活菌數(shù)、總糖、酒精和滴定酸含量及CO2失重量的變化，考察了不同時期接種醋酸菌對酵母酒精發(fā)酵的影響。

1 試 驗

1.1 主要材料

裂殖酵母（Schizosaccharomycessp.），由本實驗室從草莓自然發(fā)酵醪中分離獲得并保存［6］；醋酸桿菌（Acetobacterpasteurianus）AS1.41，上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司。

濃縮蘋果汁（70.2°Bx），大連海升果業(yè)有限責任公司。

1.2 主要儀器與試劑

722G 可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；WYT－5手持糖量折光儀，上海大慶光線儀器廠。

無水乙醇、氫氧化鈉、3，5－二硝基水楊酸、偏重亞硫酸鉀、重鉻酸鉀、濃硫酸等均為分析純；注射用青霉素鈉（400萬U／g）；注射用硫酸鏈霉素（100萬U／g）；制霉素片（50萬單位／片）。

1.3 培養(yǎng)基及其制備

1.3.1 酵母菌培養(yǎng)基

菌種保藏與活化培養(yǎng)基（g／L）：蛋白胨20，酵母浸粉10，葡萄糖20，瓊脂20，pH 6.0，于115 ℃滅菌30min。

平板計數(shù)培養(yǎng)基（g／L）：同菌種保藏與活化培養(yǎng)基，滅菌冷卻至50 ℃左右加入青霉素鈉60mg／L和硫酸鏈霉素100mg／L［6－7］。

一級液體種子培養(yǎng)基：同菌種保藏與活化培養(yǎng)基，但不加瓊脂。

二級液體種子培養(yǎng)基：15.2°Bx 蘋果汁，于115 ℃滅菌30min。

酒精發(fā)酵培養(yǎng)基：15.2°Bx蘋果汁，加入偏重亞硫酸鉀200mg／L。

1.3.2 醋酸菌培養(yǎng)基

菌種保藏與活化培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖10，酵母膏10，CaCO320，瓊脂20，pH 自然，于115 ℃滅菌30min，冷卻至50 ℃左右加入體積分數(shù)3%的無水乙醇。

平板計數(shù)培養(yǎng)基：同菌種保藏與活化培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至50 ℃左右加入50mg／L 的制霉菌素［7－8］。

液體種子培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖15，酵母膏10，K2HPO40.5，MgSO40.5，115℃滅菌30min，使用前加入體積分數(shù)3%的無水乙醇。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 酵母種子液的制備

取4 ℃保藏的酵母菌接種于活化培養(yǎng)基中，于30 ℃活化培養(yǎng)24h。取2環(huán)活化好的菌種接入一級種子培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)24h。二級種子培養(yǎng)基中接入體積分數(shù)10%的一級種子液，于30 ℃、160r／min搖床培養(yǎng)13h，得成熟二級種子液。

1.4.2 醋酸菌種子液的制備

將4 ℃保藏的醋酸菌接入活化培養(yǎng)基中，于30 ℃活化培養(yǎng)72h。取2環(huán)活化好的菌種接入液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、120r／min搖瓶培養(yǎng)30h，得成熟種子液。

1.4.3 酵母乙醇發(fā)酵

向酒精發(fā)酵培養(yǎng)基中接入體積分數(shù)10%的成熟酵母二級種子液，10層紗布封口，于25 ℃、120r／min搖床培養(yǎng)8h，再用發(fā)酵栓取代紗布封口，于25 ℃靜止培養(yǎng)12d。

1.5 不同階段接入醋酸菌對酒精發(fā)酵的影響

分別向發(fā)酵第1、4和7天的酒精發(fā)酵液中接入一定量成熟醋酸菌種子液，以未接醋酸菌為對照，考察不同時期接入醋酸菌對酒精發(fā)酵的影響。

1.6 分析方法

采用標準堿滴定法［9］滴定酸含量（以蘋果酸計）；采用硫酸－重鉻酸鉀氧化比色法［10］測定乙醇含量；采用稀釋涂平板法［11］測定酵母、醋酸菌活菌數(shù)；總糖含量測定：先將發(fā)酵上清液用6mol／L HCl水解后中和，再采用DNS法測定［12］；采用稱重法［13］測定CO2失重量。

2 結(jié)果與討論

2.1 醋酸菌對酵母酒精發(fā)酵過程中微生物生長的影響

分別在酒精發(fā)酵前、中和后期接入醋酸菌，發(fā)現(xiàn)酵母菌的生長規(guī)律與對照組相同（見圖1）。而不同時期接入的醋酸菌活菌數(shù)的變化卻有明顯區(qū)別（見圖2），其中，中期接入的醋酸菌活菌數(shù)在整個發(fā)酵過程中基本穩(wěn)定，表明中期接種更適宜醋酸菌的生存；而前期和后期接種并不利于醋酸菌的生存。

圖1 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中酵母活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of AAB on viable counts of yeast in alcoholic fermentation

圖2 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中醋酸菌活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of AAB on viable counts of AAB in alcoholic fermentation

在發(fā)酵前期，酵母正處于快速生長期，僅有少量酒精生成；而且此時發(fā)酵液中游離SO2濃度較高，對前期接種的醋酸菌的生長有較強的抑制作用［14］。此外，不斷降低的溶氧也對嚴格好氧的醋酸菌的生長代謝非常不利，導致醋酸菌活菌數(shù)逐漸降低。在發(fā)酵中期，SO2濃度較低，對中期接入的醋酸菌的生長抑制作用較小，發(fā)酵生成的一定量酒精也為醋酸菌的生長提供了能量，醋酸菌活菌數(shù)才能夠保持相對穩(wěn)定。后期接種醋酸菌活菌數(shù)呈下降趨勢，這可能是由于發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣較匱乏，生成較多的酒精嚴重影響了后期接入醋酸菌的生長代謝活性。

2.2 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中酒精質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖3知，不同時期接入醋酸菌對最終酒精含量影響較小。而在前期接種醋酸菌后的第2～10天內(nèi)，酒精產(chǎn)率與產(chǎn)量均低于對照組，說明前期接入醋酸菌明顯抑制了酵母的發(fā)酵活性。酒精發(fā)酵前期，發(fā)酵液中相對較高的溶氧及一定量的乙醇為醋酸菌有氧代謝提供了條件；其代謝產(chǎn)物導致發(fā)酵液環(huán)境的變化，影響了酵母酒精發(fā)酵活性，使產(chǎn)酒速率降低。中期接種醋酸菌的酒精產(chǎn)率比對照組高，酒精產(chǎn)量也較對照組提前2d達到最大，說明中期接種醋酸菌加速了酒精發(fā)酵。后期接種醋酸菌對最終酒精產(chǎn)量影響較小，可能與酒精發(fā)酵基本結(jié)束和醋酸菌代謝活性受環(huán)境條件限制有一定關(guān)系。

圖3 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中酒精質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.3 Effect of AAB on ethanol content in alcoholic fermentation

2.3 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中總糖質(zhì)量濃度的影響

酵母通過無氧代謝將部分糖轉(zhuǎn)化為酒精。由圖4可見，前期接入醋酸菌的耗糖速率明顯低于對照組，這一結(jié)果與同期酒精含量的變化趨勢有一定的對應關(guān)系。可推測醋酸菌是通過影響糖代謝來影響酵母乙醇代謝活性。中期接入醋酸菌的降糖速率較快，可能是因為酒精發(fā)酵中期的環(huán)境有利于醋酸菌的生長，從而加速了糖的消耗。后期接入醋酸菌對降糖影響較小?？傮w來說，隨著接種時間的延后，對降糖的影響逐漸減小。

圖4 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中總糖質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of AAB on total sugar content in alcoholic fermentation

2.4 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中滴定酸質(zhì)量濃度的影響

由圖5可知，不同時期接入醋酸菌的發(fā)酵液中滴定酸質(zhì)量濃度的變化大致呈先升高后降低的趨勢，而發(fā)酵8～10d，不同時期接種醋酸菌的滴定酸質(zhì)量濃度均較對照組有不同程度的升高。結(jié)合中期接種醋酸菌的酒精變化（圖3）可知，中期滴定酸質(zhì)量濃度的升高可能由酒精轉(zhuǎn)化為醋酸所致。前期接種醋酸菌的酒精發(fā)酵后期滴定酸質(zhì)量濃度突然升高，其原因有待進一步研究。

2.5 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中CO2 失重量的影響

酒精發(fā)酵過程中CO2失重量的變化反應酵母發(fā)酵力的強弱。由圖6可見，前期接種明顯低于其他3組，這與圖2、3中相對應的接種情況下總糖與酒精質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢相符，進一步證實了前期接種醋酸菌對酵母代謝活性有明顯的抑制作用。后期接種醋酸菌的CO2失重量變化與對照組相近，說明后期接種醋酸菌對酵母代謝活性幾乎無影響。而中期接種醋酸菌的CO2失重量較對照組和后期接種均提前保持不變，說明酒精發(fā)酵提前結(jié)束。

圖5 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中滴定酸質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of AAB on titratable acid content in alcoholic fermentation

圖6 醋酸菌對酒精發(fā)酵過程中CO2 失重量的影響Fig.6 Effect of AAB on CO2releasing quantities in alcoholic fermentation

3 結(jié) 論

酵母菌生理狀態(tài)及發(fā)酵液理化性質(zhì)的差異使醋酸菌對酒精發(fā)酵的影響有別。前期接種醋酸菌對酒精發(fā)酵的影響最大，降低了酵母的發(fā)酵活力，使降糖和產(chǎn)酒速率降低，發(fā)酵周期延長。中期接種，醋酸菌的生長加速了酒精發(fā)酵，使發(fā)酵周期縮短。因環(huán)境條件惡劣不利于醋酸菌的生長代謝，后期接種醋酸菌對酒精發(fā)酵幾乎沒影響。與前期和后期接種醋酸菌相比，中期接種更有利于醋酸菌的生存，其活菌數(shù)量能夠在較長時間內(nèi)維持較高水平，有利于后續(xù)醋酸發(fā)酵的快速啟動。然而，前期接種醋酸菌使酒精發(fā)酵后期滴定酸含量驟升的原因仍需進一步研究。

目前，關(guān)于酵母與醋酸菌混合發(fā)酵釀造食醋的報道［2－4，15］均在酒精發(fā)酵初始階段同 時接種，缺乏理論依據(jù)。本研究通過在酒精發(fā)酵的不同時期接入醋酸菌，研究醋酸菌對酵母酒精發(fā)酵的影響，以期為簡化果醋發(fā)酵工藝奠定基礎(chǔ)。

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