王端，周鴻翔，田婭玲，柳蔭，陳龍，吳鳳智，邱樹(shù)毅*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)試驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

微波輔助提取葛根黃酮的工藝研究

王端1，2，周鴻翔1，2，田婭玲1，2，柳蔭1，2，陳龍1，2，吳鳳智1，2，邱樹(shù)毅1，2*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)試驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

以葛根為原料，乙醇為溶劑，采用微波輔助提取葛根總黃酮?？疾炝巳軇w積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間、微波功率以及提取次數(shù)對(duì)提取液葛根總黃酮含量的影響。并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平的中心組合試驗(yàn)，通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化確定葛根總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明，在乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、固液比1∶25、提取時(shí)間31s、微波功率539W、提取次數(shù)為2次的條件下總黃酮含量最高，模型預(yù)測(cè)值可達(dá)7.26mg/g，實(shí)際驗(yàn)證值為7.32mg/g。

微波輔助提取；葛根；黃酮；響應(yīng)面；優(yōu)化試驗(yàn)

葛根為豆科多年生落葉藤本植物野葛或粉葛的塊根或塊狀莖，素有“亞洲人參”的美譽(yù)，性涼、味甘、辛，具有清熱解毒、解表利便之功效[1-2]。我國(guó)衛(wèi)生部2002年正式公布葛根為“藥食同源植物”，并為中國(guó)藥典所收載[3]，其藥用價(jià)值在李時(shí)珍《本草綱目》中已有所記載。葛根中有效成分主要是黃酮類物質(zhì)，包括葛根素、葛根苷元、葛根苷等，具有降低血管阻力、增加腦流量、改善腦及冠脈循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功效，同時(shí)具有明顯的抗自由基作用以及用于酒精中毒導(dǎo)致肝損傷的治療等功能[4-5]。

目前葛根黃酮作為許多解酒藥物和保健食品的主要功能成分越來(lái)越受到普遍重視，而高品質(zhì)葛根黃酮的獲得主要依賴于對(duì)傳統(tǒng)提取方法的改良和工藝條件的優(yōu)化。近年來(lái)，微波輔助萃取技術(shù)在天然產(chǎn)物有效成分的提取方面得到廣泛應(yīng)用，利用微波對(duì)細(xì)胞的破壁和加熱作用，可加速細(xì)胞內(nèi)有效成分的快速溶出[6]。與傳統(tǒng)方法相比，微波具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高、提取時(shí)間較短等特點(diǎn)[7]。本試驗(yàn)采用微波輔助提取法，研究相關(guān)因素對(duì)葛根黃酮提取率的影響，用響應(yīng)面設(shè)計(jì)篩選出最佳的提取工藝參數(shù)，從而為以黃酮為原料的藥物和保健品的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根塊狀根：市售，粉碎后過(guò)80目篩，密封冷凍保存。

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-60BE01B高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：廣東美的精品電器制造有限公司；MM721NH1-PW微波爐：廣東美的微波電器制造有限公司；80-2電動(dòng)離心機(jī)：常州澳華儀器有限公司；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：蘇州儀器有限責(zé)任公司；FA2004N電子精密天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛根黃酮的提取工藝流程

葛根→粉碎→過(guò)80目篩→乙醇浸提→提取液4 000r/min離心20min→分離取上清液→波長(zhǎng)250nm處測(cè)定吸光度值→計(jì)算總黃酮含量

1.3.2 提取液中總黃酮含量的測(cè)定

（1）葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8]

準(zhǔn)確稱取于120℃干燥至質(zhì)量恒定的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5.00mg于10mL小燒杯中，加入適量的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇充分溶解，然后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇定容，充分搖勻即得0.20mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取上述標(biāo)液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL分別置5個(gè)10mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇補(bǔ)足至1.0mL，再加蒸餾水稀釋定容。同時(shí)以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇1.0mL，用蒸餾水稀釋至10mL作為空白對(duì)照，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)250nm處分別測(cè)定其吸光度值。以葛根素濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）總黃酮含量的測(cè)定

將過(guò)濾后的葛根提取上清液定容至100mL，準(zhǔn)確吸取4mL溶液于10mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇定容；吸取1mL溶液置于10mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋定容；同樣以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇1mL，用蒸餾水稀釋至10mL，作為空白對(duì)照，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)250nm處測(cè)定吸光度值，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)葛根樣品的總黃酮含量?？傸S酮含量定義為提取每克葛根粗粉所提取到的總黃酮質(zhì)量數(shù)，mg。

式中：C為總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；25為每毫升黃酮提取液的稀釋倍數(shù)；100為過(guò)濾后所得上清液的定容體積，mL；m為葛根粗粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選取不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、微波時(shí)間、微波功率和提取次數(shù)，按葛根黃酮提取方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各單因素對(duì)黃酮提取率的影響。

1.3.4 中心組合試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間、微波功率的4因素3水平的中心組合試驗(yàn)。以黃酮含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法確定提取最佳工藝條件。中心組合試驗(yàn)因素水平編碼表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葛根素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制的葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為y=76.414x+0.013 5，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 6；式中y為吸光度值，x為總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL。結(jié)果表明，在葛根素質(zhì)量濃度為0.004～0.020mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of puerarin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的影響

稱取2g經(jīng)干燥粉碎至80目的葛根粗粉于平底燒瓶中，按照料液比為1∶20的比例加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇40mL，在微波功率為385W，時(shí)間為40s的條件下進(jìn)行微波提取，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids content

從圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取液總黃酮含量先增后減，且在體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最大。這是因?yàn)橐掖紝?duì)黃酮的溶解度比水大，對(duì)細(xì)胞的破壞作用比水強(qiáng)[9]，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高或過(guò)低均不利于總黃酮的提?。淮送?，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，部分脂溶性黃酮一并提取，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時(shí)，水溶性黃酮的溶解度降低，不利于提取，總黃酮含量下降[10]。所以提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.2.2 固液比對(duì)總黃酮含量的影響

稱取2g經(jīng)干燥粉碎至80目的葛根粗粉于平底燒瓶中，按固液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，在微波功率為385W，時(shí)間為40s的條件下進(jìn)行微波提取，結(jié)果如圖3所示。

圖3 固液比對(duì)總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids content

從圖3可以看出，隨著液體量的增加，總黃酮含量呈現(xiàn)先增大后緩慢減小的趨勢(shì)，固液比為1∶20時(shí)，黃酮含量達(dá)到最大。這是因?yàn)楫?dāng)液體量在一定范圍內(nèi)時(shí)，黃酮含量的高低與黃酮向溶劑中擴(kuò)散有關(guān)，固液比較小，兩相界面間的濃度差小，不利于黃酮的擴(kuò)散；但當(dāng)固液比較大時(shí)，黃酮質(zhì)量濃度下降，已浸出的黃酮不利于未浸出的黃酮的協(xié)同浸提，因而總黃酮含量反而降低[9]。因此，微波提取的最佳固液比為1∶20。

2.2.3 微波時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

稱取2g經(jīng)干燥粉碎至80目的葛根粗粉于平底燒瓶中，按料液比為1∶20的比例加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇40mL，在微波功率為385W，作用時(shí)間分別為20s、30s、40s、50s、60s的條件下進(jìn)行微波提取，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on total flavonoids content

從圖4可以看出，總黃酮含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先緩慢增大后迅速降低，40s時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)槲⒉ǖ淖饔脵C(jī)制是微波直接作用于分子，使分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，從而引起溫度升高，一定時(shí)間之后可以使細(xì)胞破裂完全，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分更快的分離浸提出來(lái)[11]；但長(zhǎng)時(shí)間處理可能導(dǎo)致葛根中的黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞從而使黃酮含量下降。因此，微波提取的最佳時(shí)間為40s。

2.2.4 微波功率對(duì)總黃酮含量的影響

稱取2g經(jīng)干燥粉碎至80目的葛根粗粉于平底燒瓶中，按料液比為1∶20的比例加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇40mL，提取時(shí)間為40s，在微波功率分別為119W、231W、385W、539W、700W的條件下進(jìn)行微波提取，結(jié)果如圖5所示。

圖5 微波功率對(duì)總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of microwave power on total flavonoids content

從圖5可以看出，隨著微波功率的增加，黃酮含量先增后減，且在385W時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)殡S著微波功率的增加，加熱速率增大，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，黃酮類物質(zhì)的含量增大；但微波功率過(guò)大時(shí)，一方面強(qiáng)熱效應(yīng)破壞了溶液中已有的黃酮成分；另一方面微波功率過(guò)大導(dǎo)致的高溫使蛋白質(zhì)凝固，黃酮成分不易破壁溶出[12-13]。因此，微波萃取的最佳功率為385W。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響

稱取2g經(jīng)干燥粉碎至80目的葛根粗粉于平底燒瓶中，按料液比為1∶20的比例加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇40mL，在微波功率為385W，時(shí)間為40s的條件下分別提取1、2、3、4、5次，結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響Fig.6 Effect of extraction times on total flavonoids content

從圖6可以看出，總黃酮含量隨著提取次數(shù)的增加而增大，但在提取2次之后升高幅度基本趨于穩(wěn)定。因此，為節(jié)約成本和簡(jiǎn)化試驗(yàn)，將微波提取的次數(shù)選定為2次。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14-15]，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、固液比（B）、提取時(shí)間（C）、微波功率（D）4個(gè)因素為自變量，以總黃酮含量（Y）為目標(biāo)函數(shù)，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。采用Design Expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，回歸方程的方差顯著性檢驗(yàn)分析結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experimental

由表3可以看出，一次項(xiàng)中，各因素對(duì)總黃酮含量的影響由大到小依次為固液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波功率>提取時(shí)間，其中固液比的影響極顯著（P<0.01）；二次項(xiàng)中A、B、C、D對(duì)總黃酮含量的影響都達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；交互項(xiàng)中，AB、AC、BD、CD均對(duì)葛根總黃酮含量有顯著的影響（P<0.05），而AD、BC之間的交互作用不顯著。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

以A、B、C、D為自變量，葛根總黃酮含量Y（mg/g）為響應(yīng)值，建立二次響應(yīng)面回歸模型，經(jīng)Design-Expert 7.0軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合后，得回歸方程：

從表4可知，以總黃酮含量為響應(yīng)值時(shí)，模型P＝0.000 2< 0.01，表明該二次方程模型顯著。同時(shí)失擬項(xiàng)P＝0.100 1< 0.05，表示響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，即可以使用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

2.3.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖7～圖12，比較2組圖的響應(yīng)面最高點(diǎn)和等高線可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面最高點(diǎn)，同時(shí)也是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)。

由圖7可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比對(duì)總黃酮含量有交互影響，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加、固液比的增大，總黃酮含量先增后減。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)約為60%、固液比約為1∶20時(shí)，響應(yīng)值可達(dá)到較高值。

由圖8可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的交互影響與圖8相比較，對(duì)響應(yīng)值交互影響的范圍相對(duì)比較窄。在乙醇體積分?jǐn)?shù)約為60%，提取時(shí)間約為40s時(shí)總黃酮含量可達(dá)最佳。

由圖9可看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加、微波功率的增大，總黃酮含量先增后減，但變化不很顯著，且A、D對(duì)響應(yīng)值交互影響的范圍窄。在乙醇體積分?jǐn)?shù)約為60%，微波功率約為385W時(shí)可達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比對(duì)黃酮提取率影響的相應(yīng)曲面及等高線Fig.7 Response surface plot and contour line of interaction between ethanol volume fraction and solid to liquid ratio on flavonoid extraction ratio

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率影響的相應(yīng)曲面及等高線Fig.8 Response surface plot and contour line of interaction between ethanol volume fraction and extraction time on flavonoid extraction ratio

由圖10可看出，隨著固液比的增加，提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量先增后減，但變化不太明顯。因此，從成本考慮溶劑加入量要適宜。

圖9 微波功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率影響的相應(yīng)曲面及等高線Fig.9 Response surface plot and contour line of interaction between microwave power and ethanol volume fraction on flavonoid extraction ratio

圖10 提取時(shí)間和固液比對(duì)黃酮提取率影響的相應(yīng)曲面及等高線Fig.10 Response surface plot and contour line of interaction between extraction time and solid to liquid ratio on flavonoid extraction ratio

由圖11可看出，固液比和微波功率對(duì)總黃酮含量的交互影響顯著。微波功率對(duì)響應(yīng)值的影響明顯強(qiáng)于固液比，固液比在1∶15～1∶25的范圍內(nèi)，總黃酮含量隨微波功率的增大而增大。但在1∶20～1∶25的范圍內(nèi)，增加幅度較大。經(jīng)分析，固液比約為1∶20～1∶25、微波功率約為385～539W時(shí)響應(yīng)值可到達(dá)較高值。

圖11 微波功率和固液比對(duì)黃酮提取率影響的相應(yīng)曲面及等高線Fig.11 Response surface plot and contour line of interaction between microwave power and solid to liquid ratio on flavonoid extraction ratio

圖12 微波功率和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率影響的相應(yīng)曲面及等高線Fig.12 Response surface plot and contour line of interaction between microwave power and extraction time on flavonoid extraction ratio

由圖12可知，提取時(shí)間短、微波功率低時(shí)，總黃酮含量低；但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、微波功率過(guò)高時(shí)也會(huì)導(dǎo)致總黃酮含量下降，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)、微波功率過(guò)高會(huì)導(dǎo)致溫度過(guò)高從而使黃酮分解。提取時(shí)間約為30～50s，微波功率約為385W可達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。

2.4 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證結(jié)果

采用Design-Expert7.0軟件優(yōu)化的提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)56.36%，固液比1∶25，提取時(shí)間31.27s，微波功率539W，總黃酮含量預(yù)測(cè)值為7.26mg/g。與實(shí)際最優(yōu)工藝條件相比，提取時(shí)間31.27s相對(duì)40s有所降低，而微波功率539W相對(duì)385W明顯提高。考慮到實(shí)際工作的便利，將提取工藝修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)56%，固液比1∶25，提取時(shí)間31s，微波功率539W，采用修正后的工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得總黃酮含量為7.32mg/g，比預(yù)測(cè)值提高了0.83%，說(shuō)明響應(yīng)面法對(duì)黃酮提取量的優(yōu)化具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究以葛根為原料，以葛根總黃酮的含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法建立了響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型。最終確定了微波法提取葛根黃酮的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、固液比1∶25、提取時(shí)間31s、微波功率539W，在此優(yōu)化條件下測(cè)得葛根總黃酮含量為7.32mg/g，比預(yù)測(cè)值提高了0.83%，表明響應(yīng)面設(shè)計(jì)在葛根黃酮提取工藝中可行，結(jié)果可靠。

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Microwave-assisted extraction process of flavonoids fromRadix puerariae

WANG Duan1,2,ZHOU Hongxiang1,2,TIAN Yaling1,2,LIU Yin1,2,CHEN Long1,2,WU Fengzhi1,2,QIU Shuyi1,2*
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Key Lab of Fermenting Engineering and Bio-pharmacy,Guiyang 550025,China)

The total flavonoids were extracted with ethanol as solvent fromRadix puerariaeby microwave-assisted extraction.The effects of ethanol volume fraction,solid to liquid ratio,extraction time,microwave power and extraction times on the flavonoid yield was investigated.On the basis of single factor experiments,a Box-Benhnken design involving four variables at three levels was employed,and the optimal values of these variables were determined by response surface analysis.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows:ethanol volume fraction 56%,solid to liquid ratio 1∶25,extraction time 31 s,microwave power 539 W and extraction times 2.Under this condition,the actually total flavonoid content was the highest with effective value was 7.32 mg/g,while the predicted value of the maximal yield of flavonoids was 7.26 mg/g.

microwave-assisted extraction;Radix puerariae;flavonoids;responses surface methodology;optimization experiment

O658

A

0254-5071（2014）03-0081-06

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.020

2014-01-20

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合NZ20133016）

王端（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锎蠓肿印?/p>

*通訊作者：邱樹(shù)毅（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。