何茹，劉婭*，謝曉霞，王陳強(qiáng)

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆冠農(nóng)果茸集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，新疆庫(kù)爾勒841000）

內(nèi)生黑曲霉產(chǎn)脂肪酶條件研究及其粗酶酶學(xué)特性

何茹1，劉婭1*，謝曉霞2，王陳強(qiáng)2

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆冠農(nóng)果茸集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，新疆庫(kù)爾勒841000）

針對(duì)新疆釀酒葡萄中獲得的1株產(chǎn)脂肪酶的內(nèi)生黑曲霉菌株C2J6，研究了該菌株的產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性。結(jié)果表明，該菌適宜的產(chǎn)酶條件為1%的乳糖為碳源，1%的蛋白胨為氮源，培養(yǎng)基初始pH值為8.0，培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間約72h，此時(shí)所產(chǎn)脂肪酶的活力可達(dá)18.75U/mL。該菌所產(chǎn)脂肪酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH值為7.0，為中溫中性酶；在50℃保溫1h酶活力保留54.55%，具有良好的熱穩(wěn)定性；在pH值3.0～7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，有一定的耐酸性。金屬離子Mn2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，Zn2+、Fe2+、Cu2+對(duì)酶活力有抑制作用，K+、Ca2+、Na+、Mg2+對(duì)酶活力影響不大。該酶在以葵花油和谷物調(diào)和油為底物時(shí)，酶活分別為228%和180%，明顯高于橄欖油和油煙機(jī)廢油。

內(nèi)生黑曲霉；脂肪酶；產(chǎn)酶條件；酶學(xué)特性

脂肪酶（EC3.1.1.3）又稱三?；视王；饷?，可將甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或進(jìn)行其逆反應(yīng)，在油-水界面及非水介質(zhì)中催化酯的水解和合成，酯交換，催化生物表面活性劑、高聚合物、多肽和手性藥物的有機(jī)合成反應(yīng)等[1]。目前，脂肪酶已廣泛應(yīng)用于食品、香料、醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑、皮革、藥物合成、有機(jī)合成等領(lǐng)域[2-4]。微生物脂肪酶因其具有較動(dòng)植物脂肪酶更好的穩(wěn)定性、選擇性、底物特異性、更廣的作用pH值和溫度范圍，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，便于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此成為工業(yè)脂肪酶的最重要來源。由于植物內(nèi)生環(huán)境這個(gè)微生態(tài)體系的特殊性，其中的微生物脂肪酶也可能表現(xiàn)出與眾不同的特性。已有研究表明，植物內(nèi)生菌脂肪酶不僅具有普通脂肪酶的一些性質(zhì)，而且有一些特殊的性質(zhì)（如耐熱、耐有機(jī)溶劑、耐堿等），是挖掘和分離新型工業(yè)用脂肪酶的潛在理想源泉[5]。新疆地處祖國(guó)西部邊陲，多樣化的氣候和環(huán)境條件勢(shì)必造成新疆葡萄內(nèi)生菌資源的特異性和多樣性[6]。本研究針對(duì)從新疆釀酒葡萄內(nèi)生菌中篩選獲得的一株產(chǎn)脂肪酶的高活力菌株——黑曲霉（Aspergillus niger）C2J6，了解其產(chǎn)脂肪酶條件，并對(duì)其粗酶學(xué)特性進(jìn)行研究[7-14]，從而為該菌的開發(fā)利用奠定扎實(shí)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）C2J6：新疆釀酒葡萄內(nèi)生菌，石河子大學(xué)食品學(xué)院分離獲得。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；橄欖油：上海嘉里食品工業(yè)有限公司；乳糖、KH2PO4、NaOH、酚酞、（NH4）2SO4、NH4Cl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、KCl、FeSO3·7H2O、聚乙烯醇、95%vol乙醇等均為分析純：天津市北辰方正試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用固體馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂15～20g，水（加至）1 000mL，pH自然，121℃滅菌20min，。

液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，定容至1L，pH值7.0，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：橄欖油乳化液10g，NaCl10g，NH4Cl0.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.1g，KCl 0.1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH自然，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FA1004型電子天平：上海精科天平儀器廠；LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JJ-2型組織搗碎儀：江蘇省金市榮華儀器廠；HHS-216型恒溫水浴槽：常州國(guó)華電器有限公司；722可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-111B型恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZXSD-1160型培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

（1）斜面培養(yǎng)：采用固體馬鈴薯培養(yǎng)基，滅菌后將保藏的C2J6菌株接種在斜面上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

（2）種子培養(yǎng)：250mL的三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上取1環(huán)菌，接種在液體種子培養(yǎng)基中（菌懸液中約107個(gè)孢子/mL），30℃、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h。

（3）產(chǎn)酶培養(yǎng)：250mL的三角瓶裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種種子液，接種量2%，30℃、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)72h。

1.3.2 產(chǎn)酶條件研究

采用液體搖瓶培養(yǎng)，主要研究培養(yǎng)時(shí)間、碳源、氮源、誘導(dǎo)物、培養(yǎng)溫度等條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)脂肪酶酶活的影響。

1.3.3 粗酶液的制備

產(chǎn)酶培養(yǎng)后的發(fā)酵液在5 000r/min條件下離心10min，取上清液，即為粗酶液。

1.3.4 脂肪酶活力測(cè)定

采用施巧琴[15]的脂肪酶活力測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)。脂肪酶活力計(jì)算公式如下：

式中：V為滴定樣液消耗的NaOH體積，mL；V0為滴定空白樣消耗的NaOH體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min；n為酶液體積，mL；M為滴定用的NaOH溶液的濃度，mol/mL。

相對(duì)酶活是指所測(cè)得的酶活力值與橄欖油乳化液作為底物時(shí)酶液不經(jīng)過處理的酶活力值的百分比。

1.3.5 菌絲體干質(zhì)量的檢測(cè)

將黑曲霉C2J6進(jìn)行發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，每隔12h從三角瓶中取樣，用干燥至質(zhì)量恒定的定量濾紙過濾獲得菌絲體，將菌絲體置于105℃烘箱中干燥脫水至質(zhì)量恒定，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量。

1.3.6 脂肪酶酶學(xué)特性研究

對(duì)以最佳產(chǎn)酶條件所產(chǎn)脂肪酶的粗酶液進(jìn)行主要酶學(xué)特性研究，包括最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度、熱穩(wěn)定性、金屬離子以及底物等對(duì)脂肪酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶條件研究

不同菌株產(chǎn)生的脂肪酶具有不同的酶學(xué)特性和用途，為研究C2J6菌株產(chǎn)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)，首先對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步探究。

2.1.1 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將黑曲霉C2J6進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，每隔12h取樣，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量及不同培養(yǎng)時(shí)間下的脂肪酶活，結(jié)果見圖1。由圖1可知，24～48h菌體生長(zhǎng)緩慢，酶活較低；培養(yǎng)72h時(shí)酶活力最高，此時(shí)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；90h之后菌體生長(zhǎng)延遲，酶活迅速降低。

圖1 C2J6的生長(zhǎng)曲線與酶活變化Fig.1 Growth curve and enzyme activity of stain C2J6

2.1.2 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳源是微生物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)素，是給菌體提供生命活動(dòng)所需要的能量以及構(gòu)成菌體的細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)。以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以1%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、可溶性淀粉作為碳源，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所產(chǎn)脂肪酶活性見圖2。由圖2可知，乳糖更有利于產(chǎn)酶，酶活力為6.50U/mL。

圖2 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source on lipase production

2.1.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源是構(gòu)成菌體的重要物質(zhì)，對(duì)菌體所產(chǎn)酶的酶活有重大影響。以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，1%乳糖為碳源，分別以1%的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、黃豆粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4Cl作為氮源，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所產(chǎn)脂肪酶活性見圖3。由圖3可知，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于菌株產(chǎn)酶，蛋白胨為氮源時(shí)，脂肪酶活力最高，酶活力為17.25U/mL。

圖3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on lipase production

2.1.4 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

以1%乳糖為碳源、1%蛋白胨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定不同的pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所產(chǎn)脂肪酶活性見圖4，可知當(dāng)pH為8.0時(shí)菌株產(chǎn)酶最高，酶活力可達(dá)18.25U/mL，且pH在7.5～8.5的范圍內(nèi)適宜產(chǎn)酶。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)溫度不僅影響菌體的生長(zhǎng)，而且影響微生物體內(nèi)酶的合成。以1%乳糖為碳源、1%蛋白胨為氮源、初始pH值為8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定不同的發(fā)酵溫度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所產(chǎn)脂肪酶活性見圖5。由圖5可知，發(fā)酵溫度對(duì)該菌產(chǎn)酶有較大影響，發(fā)酵培養(yǎng)30～40℃時(shí)產(chǎn)酶活性比較高，低溫或高溫發(fā)酵時(shí)酶活顯著降低，因此確定最佳搖瓶發(fā)酵溫度為35℃，酶活力可達(dá)18.75U/mL。

圖4 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of initial pH on lipase production

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on lipase production

2.2 酶學(xué)特性研究

2.2.1 酶反應(yīng)最適溫度

為了測(cè)定酶反應(yīng)的最適溫度，將反應(yīng)溫度設(shè)置為10個(gè)梯度：4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。在反應(yīng)組里加入1mL酶液，分別置于10種溫度條件下進(jìn)行水解反應(yīng)15min，測(cè)定酶活。由圖6可知，酶反應(yīng)的最適溫度為40℃，且在20～50℃條件下仍有較高的活力。

圖6 溫度對(duì)脂肪酶活的影響Fig.6 Effect of temperature on lipase activity

2.2.2 酶的熱穩(wěn)定性

將恒溫水浴溫度設(shè)置為6個(gè)梯度：4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃。取5mL酶液分別置于不同溫度的恒溫水浴鍋中保溫1h，測(cè)定脂肪酶的酶活力。由圖7可知，該酶具有較好的熱穩(wěn)定性，在20～40℃的條件下，保溫1h，其相對(duì)酶活力仍保持在60%以上；溫度高于50℃時(shí)，酶活性迅速下降；在60℃時(shí)，相對(duì)酶活力下降至不足5%。

圖7 溫度對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on lipase stability

2.2.3 酶反應(yīng)的最適pH值

分別將不同pH值（2.0～8.0）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與底物充分混和，加入1mL酶液在最適溫度40℃條件下反應(yīng)15min，測(cè)定酶活力。由圖8可知，該酶在pH值7.0時(shí)的酶活力最高，可知該酶為中性脂肪酶。

圖8 pH對(duì)脂肪酶活的影響Fig.8 Effect of pH on lipase activity

2.2.4 酶的pH穩(wěn)定性

將酶液與不同pH值（2.0～9.0）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液等體積混合，然后于室溫條件下放置1h，在40℃、pH值7.0的條件下反應(yīng)15min，測(cè)定酶活力。由圖9可知，在pH值5.0～7.0的范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力仍保持在70%以上，酶活性較為穩(wěn)定。

2.2.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響

在酶液中加入金屬鹽類，分別使待測(cè)金屬離子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+的濃度為5mmol/L，以未加金屬離子的酶液作為對(duì)照，然后于室溫放置1h，以對(duì)照組酶活力為100%，再測(cè)定其酶活力。由圖10可知，金屬離子Mn2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，Zn2+、Fe2+、Cu2+對(duì)酶活力有抑制作用，K+、Ca2+、Na+、Mg2+對(duì)酶活力影響不大。

圖9 pH對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on lipase stability

圖10 不同金屬離子對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.10 Effect of metal ions on lipase activity

2.2.6 底物對(duì)酶活力的影響

用葵花油、谷物調(diào)和油、油煙機(jī)廢油的乳化液作為酶液的反應(yīng)底物，以橄欖油乳化液為底物的反應(yīng)作為對(duì)照，以對(duì)照組酶活力為100%，再測(cè)定其酶活力。由圖11可知，該酶在以葵花油和谷物調(diào)和油為底物時(shí)，相對(duì)酶活分別為228%和180%，明顯高于橄欖油和油煙機(jī)廢油。

圖11 不同底物對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.11 Effect of substrates on lipase activity

3 結(jié)論

通過產(chǎn)酶條件的初步探究得出黑曲霉C2J6產(chǎn)脂肪酶的適宜培養(yǎng)條件為：在含有50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，以1%的乳糖為碳源，1%的蛋白胨為氮源，初始pH為8.0，在35℃培養(yǎng)72h，此時(shí)脂肪酶活力可達(dá)18.75U/mL。

粗酶酶學(xué)特性研究表明，黑曲霉C2J6所產(chǎn)脂肪酶的最適作用溫度為40℃，最適作用pH為7.0，為中溫中性酶。該酶在溫度20～40℃，pH為5.0～7.0的范圍內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定。此外，Mn2+以及葵花油乳化液對(duì)酶活力有一定的促進(jìn)作用。

[1]張曉鷗，周健，劉巧瑜，等.有機(jī)相脂肪酶催化合成技術(shù)在食品及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].食品生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（1）：120-126.

[2]JAEGER K E,EGGERT T.Lipases for biotechnology[J].Curr Opin Biotech,2002,13(4):390-397.

[3]喬紅群，徐虹，付閃雷，等.脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶性質(zhì)[J].南京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，20（1）：1-3.

[4]SHARMA A K,TIWARI R P,HOONDAL G S.Properties of a thermostable and solvent stable extracellular lipase from a Pseudomonas sp. AG-8[J].J Basic Microb,2001,41:363-366.

[5]TREICHEL H,DE OLIVEIRA D,MAZUTTI M A,et al.A review on microbial lipasesproduction[J].Food Bioprocess Tech,2010,3(2):182-196.

[6]時(shí)永杰，祁付云，安婷，等.釀酒葡萄中內(nèi)生霉菌的分離與初步鑒定[J].食品工業(yè)科技，2013（3）：185-191.

[7]張衛(wèi)國(guó).一株毛霉菌產(chǎn)脂肪酶特性及發(fā)酵條件研究酶活測(cè)定[J].中國(guó)釀造，2011，30（7）：134-137.

[8]李治林，李迅，王麗麗，等.米根霉產(chǎn)脂肪酶的條件及酶學(xué)性質(zhì)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，33（6）：103-107.

[9]陳貴元，季秀玲，林連兵，等.低溫脂肪酶產(chǎn)生菌篩選與鑒定、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，32（1）：108-113.

[10]李俊峰，李紅芳，段效輝，等.耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其粗酶酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2012，33（3）：116-120.

[11]趙春雷，閆麗娟，謝振榮，等.一株耐熱脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（2）：184-188.

[12]周晶.一株脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D].杭州：中國(guó)計(jì)量學(xué)院碩士論文，2012.

[13]李楠.耐冷假單胞菌Pseudomonassp.G6產(chǎn)脂肪酶條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D].哈爾濱：黑龍江大學(xué)碩士論文，2012.

[14]袁靜.耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌篩選及粗酶性質(zhì)研究[D].南京：南京工業(yè)大學(xué)碩士論文，2008.

[15]施巧琴.堿性脂肪酶的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1998，8（3）：108-110.

Conditions of lipase production by endophyticAspergillus nigerand enzymatic properties of the crude enzyme

HE Ru1,LIU Ya1*,XIE Xiaoxia2,WANG Chenqiang2
(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Technology Center,Xinjiang Guannong Fruit&Antler Group Co.,Ltd.,Korla 841000,China)

A lipase-producing strainAspergillus nigerC2J6 was screened from Xinjiang wine grape.The conditions for enzyme production and enzymatic properties of C2J6 were studied.The results showed that the suitable conditions for enzyme production were as follows:lactose 1%as carbon source,peptone 1%as nitrogen source,initial pH 8.0,culture temperature 35℃,incubation time 72 h.Under the optimal condition,the lipase activity reached 18.75 U/ml.The enzyme was medium temperature amylase,and the optimal reaction temperature,pH of crude enzyme produced by the strain was 40℃and 7.0,respectively.It had good thermal stability,54.55%of the enzyme activity could be reserved after being kept at 50℃for 1 h. Its activity was stable between pH 3.0-7.0,and it had some acid-resisting features.Mn2+could boost up enzyme activity,whereas Zn2+,Fe2+,Cu2+would restrain its activity,and K+,Ca2+,Na+,Mg2+have little effect on its activity.When the enzyme was in sunflower oil and grain as substrate,the enzyme activity was 228%and 180%,respectively,which was significantly higher than the olive oil and smoke lampblack machine oil.

endogenousAspergillus niger;lipase;enzyme producing condition;lipase properties

TQ925

A

0254-5071（2014）03-0052-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.014

2014-01-19

新疆石河子大學(xué)高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX20109）

何茹（1987-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣呒庸ぁ?/p>

*通訊作者：劉婭（1974-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。