蘇媛寧，夏玉，林捷*，張錦鵬，張歡歡，曾繁祥，張俊華

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510600）

乳酸菌蛋白降解及產(chǎn)香能力分析

蘇媛寧，夏玉，林捷*，張錦鵬，張歡歡，曾繁祥，張俊華

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510600）

研究了分離自新疆酸奶疙瘩中6株乳酸菌在37℃下蛋白質降解和產(chǎn)香能力。結果表明，6株乳酸菌穩(wěn)定期活菌數(shù)均在108CFU/mL以上，且凝乳細膩，具有良好的組織狀態(tài)。各菌株發(fā)酵性能有差異，干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、乳脂乳球菌3株菌發(fā)酵性能較植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌發(fā)酵性能優(yōu)，可用于不同風味和功能的發(fā)酵乳制品生產(chǎn)。其中，干酪乳桿菌具有良好的蛋白水解力，發(fā)酵15h，酪氨酸含量為594.33μg/mL；乳脂乳球菌產(chǎn)香性能好，發(fā)酵24h，丁二酮含量為12.32μg/mL、乙醛含量為59.27μg/mL，與其他菌株具有顯著差異；瑞士乳桿菌具有強的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏特性，發(fā)酵24h，酸度達159.76°T，黏度值1 389mPa·s。

乳酸菌；蛋白降解；丁二酮；乙醛

酸奶的風味與品質很大程度上取決于乳酸菌發(fā)酵劑[1]。風味良好，口感細滑，富含功能性多肽、具有保健功能的酸奶已經(jīng)成為乳制品行業(yè)研究的熱點。乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳酸、醋酸和醛、酮、醇、胞外多糖等物質，對酸奶的質地、風味及營養(yǎng)功能起著至關重要的作用[2-3]。另外，乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠水解乳蛋白生成小分子多肽，具有調節(jié)人體生理功能的功效[4-6]。在新疆傳統(tǒng)乳制品酸奶疙瘩中分離出6株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳脂乳球菌（Lactococcus lactis cremoris）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）。通過對6株乳酸菌發(fā)酵性能的測定，期望得到適合生產(chǎn)老酸奶的菌株。實驗對6株野生乳酸菌的活菌數(shù)、產(chǎn)酸、產(chǎn)香、蛋白降解能力等方面進行研究對比，為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權，性能優(yōu)良的發(fā)酵劑提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），簡稱Lp；乳脂乳球菌（Lactococcus lactis cremoris），簡稱Ls；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），簡稱St；保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus），簡稱Lb；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），簡稱Lc；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），簡稱Lh。以上菌種均由華南農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室提供。

脫脂乳粉（蛋白質≥30%）：新西蘭安佳。

鄰苯二甲醛：天津市大茂化學試劑廠；丁二酮：天津市福晨化學試劑廠；三氯乙酸：天津市大茂化學試劑廠；碘：廣州化學試劑廠；碘化鉀：上海銀典化工有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HG303-5恒溫培養(yǎng)箱：南京實驗儀器廠；pHs-2F型pH計：上海精科儀器有限公司；SW-CJ-IFD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DL-5低速大容量離心機：上海優(yōu)浦科學儀器有限公司；UVmin-1240型分光光度計：島津儀器有限公司；SNB-1型黏度計：上海方瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備工藝流程

脫脂乳粉復水（12%，w/v）→45℃水合30min→巴氏殺菌（85℃，5min）→冷卻至40℃→接種3%活化單菌種→37℃恒溫發(fā)酵→每3h取樣，測定指標。

1.3.2 pH與滴定酸度的測定方法

采用精密pH計于室溫條件下測定試樣pH。滴定酸度按照GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》方法進行測定。

1.3.3 活乳酸菌菌落數(shù)的測定

活乳酸菌菌落數(shù)的測定按照GB 4789.35—2010《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》方法進行測定。

1.3.4 黏度的測定

采用黏度計進行測定。

1.3.5 乙醛含量的測定

取適量試樣，與16%（w/v）三氯乙酸等體積混勻，靜置10min，3 500r/min離心10min，取上清液用濾紙過濾。取濾液25mL于碘量瓶中，加入1%NaHSO3溶液5mL，搖勻，暗處放置1h。加入淀粉指示劑1mL，用0.1mol/L碘液滴定至接近無色，再改用0.01mol/L碘溶液滴定淡藍色出現(xiàn)。加入1mol/L的NaHCO3溶液20mL，振蕩混勻，用0.01mol/L碘標準溶液滴定至淡藍色再次出現(xiàn)，記錄消耗的碘液的體積[7]。同時做空白實驗，平行3次。乙醛含量的計算公式：

式中：V1為碘標準溶液用量，mL；V2為空白實驗碘標準溶液用量，mL；C為碘標準溶液的濃度，mol/L；25為乙醛樣品稱樣量，mL；0.022為乙醛化學反應基本單元，g/mol。

1.3.6 丁二酮含量的測定

丁二酮標準曲線的制作：用微量進樣器吸取15μL丁二酮標準品，用蒸餾水定容至500mL。取12支編號的試管分成2排放置，用蒸餾水準確配制質量濃度分別為0.0﹑3.0μg/mL﹑6.0μg/mL﹑9.0μg/mL﹑12.0μg/mL﹑15.0μg/mL丁二酮標準溶液。取10mL樣液，第一排試管中加入1%鄰苯二胺溶液0.5mL，第二排試管不加為空白；搖勻后置于黑暗處放置30min。后加入4.0mol/L鹽酸終止反應，第一排試管加2.0mL，第二排試管加2.5mL，混勻后以第二排試管空白作為參比液，在波長335nm處測定吸光度值。做3個平行取平均值，以丁二酮質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線：y=0.097 8x-0.015 9，相關系數(shù)r2=0.998 6。

樣品丁二酮含量測定：樣品處理同1.3.5方法，濾紙過濾得上清液。取樣液20mL置于50mL錐形瓶中，按上述丁二酮標準曲線步驟測定吸光度值。然后查丁二酮標準曲線可獲得待測樣品中丁二酮質量濃度[7-8]。

1.3.7 蛋白水解力的測定

酪氨酸標準曲線制作：用蒸餾水準確配制質量濃度分別為0、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL的酪氨酸溶液。用移液槍分別移取150μL不同質量濃度的酪氨酸溶液，加入3mL鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）試劑[9]，混勻后室溫條件下反應2min，在波長340nm處測定吸光度值。平行3次取平均值，以酪氨酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，制作標準曲線，得回歸方程y=0.001x-0.009，相關系數(shù)r2=0.998。

樣品測定[10]：吸取2.5mL的發(fā)酵乳于試管中，加入0.5mL蒸餾水，再加入0.75mol/L的三氯乙酸5mL，混勻，室溫靜置10min后，4000r/min離心5min。取上清液測定吸光度值，查標準曲線計算相當于酪氨酸的含量。

2 結果與討論

2.1 各菌株的產(chǎn)酸特性

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵過程中酸度(A)及pH值(B)變化曲線Fig.1 Change of acidity(A)and pH(B)during fermentation by different lactic acid bacteria

由圖1可知，各乳酸菌的產(chǎn)酸能力有一定的差異。發(fā)酵過程中，滴定酸度整體呈上升趨勢，pH隨時間延長呈下降趨勢，發(fā)酵后期均趨于平穩(wěn)。Lh產(chǎn)酸能力最強，發(fā)酵24h滴定酸度為159.77°T；Ls前期產(chǎn)酸速率較快，12h以后酸度緩慢上升，這與球菌生長速度快，屬于先產(chǎn)酸類型相關[11]；發(fā)酵18h后，酸度增長趨于平緩，發(fā)酵后期，過高的酸度抑制活菌數(shù)的增長。但Lh與Ls在發(fā)酵乳的pH降至3.5左右仍能生長，說明2菌株具有強耐酸性，有利于腸道定植益生菌的開發(fā)。

2.2 各菌株的產(chǎn)香特性

乙醛和雙乙酰是酸奶中主要的風味物質。由圖2可知，乳酸菌的產(chǎn)乙醛和丁二酮含量隨著發(fā)酵時間延長，含量逐漸上升，發(fā)酵后期，含量基本穩(wěn)定，但菌種間存在差異。Ls菌株產(chǎn)香能力最強，發(fā)酵24h，乙醛含量可達59.27μg/mL，丁二酮含量為12.31μg/mL，與其他菌種存在顯著性差異（P<0.05）。Lb產(chǎn)香性能較強，發(fā)酵24h，丁二酮產(chǎn)生量為8.19μg/mL。丁二酮的產(chǎn)生與pH和菌種的活力有關[12]，當pH下降至4.5左右，有大量的丁二酮開始積累，在發(fā)酵后期，由于菌種處于穩(wěn)定及衰亡期，代謝活力較低和丁二酮的集聚，丁二酮含量保持在相對高且穩(wěn)定的狀態(tài)中。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵過程中丁二酮含量(A)及乙醛含量(B)變化曲線Fig.2 Change of butanedione content(A)and acetaldehyde content (B)during fermentation by different lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌的產(chǎn)黏特性

發(fā)酵乳的質地與胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）產(chǎn)生密切相關，王亞峰等[13]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胞外多糖乳酸菌能夠提高發(fā)酵乳的黏度，減少乳清的析出，有助于改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)和黏稠度。由圖3可知，6株乳酸菌的產(chǎn)黏性趨勢一致，發(fā)酵9h，凝乳時黏度顯著上升，后期黏度趨于平緩，個別略有下降，可能與乳清析出相關。瑞士乳桿菌發(fā)酵乳黏稠性最好，發(fā)酵12h后黏度均達到1 369mPa·s。發(fā)酵24h，各乳酸菌的產(chǎn)黏特性的大小：Lh>Lc>Lb>Ls>Lp>St，且球菌的產(chǎn)黏能力普遍低于桿菌，這主要由于球菌生成乳酸速度過快，乳酸通過抑制乳酸脫氫酶的活性，從而抑制糖代謝，影響菌體的生長，胞外多糖產(chǎn)生量減少[14]。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵過程中黏度變化曲線Fig.3 Change of viscosity during fermentation by different lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌活菌數(shù)增殖速度

由圖4可知，各乳酸菌發(fā)酵3h，已進入對數(shù)期；穩(wěn)定期出現(xiàn)在12～18h之間，隨后活菌數(shù)開始呈下降趨勢。其中，Ls的活菌數(shù)一直保持較高的水平，發(fā)酵18h活菌數(shù)達到峰值1010CFU/mL；Lh、Lc、Lb和Lp的菌數(shù)差異不顯著，穩(wěn)定期菌數(shù)保持在109CFU/mL左右；St整個過程中，相對其他菌株，活菌數(shù)一直處于較低水平，發(fā)酵15h，活菌數(shù)低于108CFU/mL。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵過程中活菌數(shù)變化曲線Fig.4 Change of viable bacteria during fermentation by different lactic acid bacteria

2.5 蛋白質水解能力

乳酸菌不能直接利用外源蛋白質和無機氮源，必須通過水解外源蛋白質或肽，提供菌體正常生長代謝對氨基酸的需要[15]，蛋白水解力的強弱與菌株的酶系相關[16]，影響菌體的正常生長。另外，適度的蛋白水解對改善制品風味以及生成活性多肽，具有重要作用。

由圖5可知，在發(fā)酵12h前，各菌株發(fā)酵產(chǎn)生的酪氨酸呈曲折增長趨勢。從乳酸菌的生長曲線可以看出，這個時期乳酸菌處于對數(shù)生長期，活力高，蛋白的水解能力強。Lc菌株蛋白水解能力最強，發(fā)酵15h，酪氨酸含量為594.33μg/mL；姜瞻梅等[17]研究中，篩選出具有強血管緊張素轉換酶（angiotensin convertingenzyme，ACE）抑制活性與蛋白水解能力的菌株主要為瑞士乳桿菌。本實驗中，瑞士乳桿菌發(fā)酵24h時，酪氨酸含量達383.5μg/mL，具有較好的蛋白水解能力，而St、Lp、Lb菌株對蛋白的降解能力保持在較低水平。

實驗中生長力較強的菌株與蛋白水解力不呈正相關，說明菌株蛋白水解力高低與生長快慢并沒有必然聯(lián)系。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵過程中酪氨酸含量變化曲線Fig.5 Change of tyrosine content during fermentation by different lactic acid bacteria

3 結論

實驗中6株乳酸菌發(fā)酵脫脂乳，均具有良好的凝乳狀態(tài)，但各菌株在產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏性能，以及對蛋白的降解能力上存在顯著差異。嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌與植物乳桿菌在各方面性能表現(xiàn)較低水平。瑞士乳桿菌具有良好的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏能力，發(fā)酵24h，酸度達159.76°T，黏度值1389mPa·s。干酪乳桿菌具有強的蛋白水解能力，發(fā)酵15h，酪氨酸最高達594.33μg/mL，乳脂乳球菌產(chǎn)香性能最好，丁二酮、乙醛產(chǎn)生量顯著高于其他菌株。綜合各指標比較，瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、乳脂乳球菌發(fā)酵性能優(yōu)，各有特色，適用于良好風味、富含活性多肽的功能性發(fā)酵乳制品開發(fā)，并提供了較全面的理論依據(jù)。

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Analysis of protein degradation and aroma-producing capacity of lactic acid bacteria

SU Yuanning,XIA Yu,LIN Jie*,ZHANG Jinpeng,ZHANG Huanhuan,ZENG Fanxiang,ZHANG Junhua
(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510600,China)

Protein degradation and aroma-producing ability of six lactic acid bacteria strains isolated from yogurt pimple were determined in skimmed milk at 37℃.The result showed that the viable bacteria of six lactic acid bacteria was up to 108CFU/ml in stable phase and the curd was smooth with good organization state.The fermentation performance of each strain was different.The characteristics ofLactobacillus casei,Lactobacillus helveticus,Lactococcus cremoriswere better than other stains includingLactobacillus plantarum,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus bulgaricus.The strains can be applied in fermented dairy products with unique flavor and special functions.L caseihad high hydrolysis efficiency and the tyrosine content was 594.33 μg/ml after incubation for 15 h.The aroma producing characteristic ofL.cremoriswas good,the content of butanedione was 12.32 μg/mL and the acetaldehyde content was 59.27 μg/mL after fermentation for 24 h,showing a significant difference with other strains.L.helveticusbehaved obvious characteristic of acidity and viscidity,the acidity reached 159.76°T and viscosity reached 1 389 mPa·s after fermentation for 24 h.

lactic acid bacteria;protein degradation;butanedione;acetaldehyde

TS252.1

A

0254-5071（2014）03-0036-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.010

2014-01-20

廣東省科技攻關項目（2012B010300019）；2012年廣東省大學生創(chuàng)新訓練項目（1056412143）

蘇媛寧（1991-），女，本科生，研究方向為食品科學與工程。

*通訊作者：林捷（1966-），女，副教授，碩士，研究方向為應用微生物與食品質量與安全控制。