張文術(shù)，張大莉，郝 君，楊 薔，董 仕

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

鯽魚屬鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidac）、鯽屬（Carassius）.我國鯽屬魚類有黑鯽（Carassius carassius）、鯽 （Carassius auratus auratus） 以及銀鯽（Carassius auratus gibelio）.依據(jù)形態(tài)、染色體數(shù)和繁殖特性將各地的鯽魚分為野鯽、紅鯽、方正銀鯽等.在選育種方面，也已培育出多個養(yǎng)殖品種或雜交種[1-3].國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用同工酶、線粒體 DNA（mtDNA）、RAPD、微衛(wèi)星DNA等遺傳標(biāo)記對野生鯽魚、選育品種、鯉鯽雜交子代等進行了多方面的遺傳分析[4-8].

同工酶由一個或多個基因座位編碼，能夠催化同一生化反應(yīng)，在電場中的運動有多種可分離形式[9].同工酶分析能夠揭示生物種群的遺傳結(jié)構(gòu)，識別從形態(tài)學(xué)上不容易區(qū)別的近緣種，也可檢測種群的遺傳多樣性，分析物種之間的親緣關(guān)系[10].檢測行有性生殖二倍體生物的同工酶的遺傳結(jié)構(gòu)，可以計算出多態(tài)基因座位的比例、單位基因座位的等位基因數(shù)、平均雜合度觀察值、平均雜合度預(yù)期值等遺傳變異指標(biāo)[11-12].鯽魚中有染色體數(shù)為100條的二倍體種群和染色體數(shù)為150條左右的三倍體種群.對于三倍體鯽魚，由于含有3套染色體組，每一基因座位有3個等位基因，依據(jù)同工酶電泳圖譜難以判別基因型，同工酶分析一般只進行電泳條帶差異性、組織表達特異性、克隆鑒別等研究[4，13-16].對于二倍體鯽魚，羅莉中等[15]、王春元等[17]、汪亞平等[18]分別對金魚的同工酶、洪湖和洞庭湖鯽魚的同工酶進行了檢測分析.作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的養(yǎng)殖種類以及雜交育種中重要的育種材料，對二倍體鯽魚遺傳結(jié)構(gòu)的研究尤為重要.本課題組應(yīng)用同工酶檢測技術(shù)研究了采自天津市獨流減河的野生鯽魚同工酶的遺傳變異情況，以期為鯽魚資源的種質(zhì)鑒定、保護利用以及遺傳育種等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 材料

2012年11月在獨流減河用刺網(wǎng)捕獲鯽魚47尾，鮮活狀態(tài)下測量體長為（11.93±1.10）cm、體重為（58.52±14.60）g，從臀鰭后尾柄基部采血制作血涂片.-20℃冷凍保存?zhèn)溆?

1.2 紅細胞大小的測量以及倍性判別

用吉姆薩染液對血涂片染色，在10×100高倍鏡下測量紅細胞的長徑.依據(jù)文獻[19]的方法進行鯽魚倍數(shù)性的判別，標(biāo)準(zhǔn)為紅細胞長徑小于15μm的為二倍體鯽魚，15～19μm為三倍體鯽魚.

1.3 同工酶電泳檢測

使用水平式淀粉凝膠電泳法檢測獨流減河鯽魚肌肉和肝臟組織的同工酶，電泳及染色方法參照文獻[20]，使用 TBE（pH8.9）、C-T（pH8.0）、C-APM（pH6.0）3種緩沖液.采用文獻 [21]的方法命名同工酶的縮寫名、編號、基因座位、等位基因和基因型.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)電泳結(jié)果判斷每尾魚每種同工酶的基因型，依據(jù)基因型計算每種同工酶的基因頻率、多態(tài)基因座位數(shù)、多態(tài)基因座位比例、單位基因座位的等位基因數(shù)、平均雜合度觀察值、平均雜合度預(yù)期值，并對有變異的基因座位進行哈代-溫伯格平衡的χ2檢驗[12].

2 實驗結(jié)果

2.1 紅細胞的大小

實驗測得獨流減河野生鯽魚紅細胞的長徑范圍為11.16～14.42μm，平均為（12.45±0.71）μm，所有個體的紅細胞長徑均小于15μm，因此判定實驗用魚均為二倍體鯽魚.

2.2 同工酶電泳結(jié)果

本研究檢測到獨流減河野生鯽魚中的7種同工酶和肌漿蛋白，其種類、編號、基因座位等如表1所示.

表1 檢測到的同工酶種類、編號及基因座位Tab.1 Isozyme names，E C numbers and loci of crucian carp

由表1可以看出，7種同工酶和肌漿蛋白共判別出18個基因座位.其中MDH的基因座位數(shù)為4個，AAT、GPI、IDH各含3個基因座位，LDH的基因座位數(shù)為2個，其余3種同工酶的基因座位數(shù)為1個.在18個基因座位中，有變異的為8個，分別是AAT-3*、GPI-1*、GPI-2*、GPI-3*、IDH-2*、ME*、PGM*和PROT*，每個等位基因的基因頻率如表2所示，部分同工酶和肌漿蛋白的電泳圖譜如圖1所示，每一條帶下方為該條帶的基因組成，由于GPI-1*和GPI-2*電泳條帶較復(fù)雜，圖中繪出其示意圖.

表2 鯽魚基因座位及其等位基因頻率Tab.2 Loci and allele frequencies of isozymes of crucian carp

圖1 鯽魚同工酶電泳圖譜Fig.1 Isozymes electrophoretogram of crucian carp

每個基因座位基因型的判別依據(jù)為：每種酶中每個條帶出現(xiàn)的位置以及每個條帶的分子構(gòu)成.對于GPI而言，由于是二聚體酶，因此每條帶都是兩條相同或者不同的多肽鏈聚合而成.由表2和圖1可以看出，同工酶GPI的3個基因座位均含有3個等位基因，AAT-3、IDH-2、PGM、PROT、ME含有 2個等位基因，其余的基因座位只有一個等位基因.

遺傳變異結(jié)果中，群體的單位基因座位的等位基因數(shù)為1.611；如果按基因座位上最高基因頻率小于0.99的為多態(tài)基因座位，則8個有變異的基因座位均為多態(tài)，多態(tài)基因座位比例為44.4%；如果按基因座位上最高基因頻率小于0.95的為多態(tài)基因座位，則GPI-1*、GPI-2*、GPI-3*、ME*4個基因座位為多態(tài)，多態(tài)基因座位比例為22.2%；平均雜合度觀察值（Ho）為0.0715，平均雜合度預(yù)期值（He）為0.0767，二者的比值為0.9322，接近于1.

對有變異的基因座位進行哈代-溫伯格平衡的χ2檢驗，結(jié)果如表3所示，p值均大于0.05，符合哈代-溫伯格平衡.

表3 鯽魚群體內(nèi)哈代-溫伯格平衡的χ2檢測Tab.3 χ2textfor departurefrom Hardy-Weinberg equilibrium in polymorphic isozyme locus of crucian carp

3 討論與結(jié)論

同工酶作為遺傳標(biāo)記之一廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物遺傳育種學(xué)研究，如物種的分類系統(tǒng)學(xué)研究[22]、遺傳多樣性分析、同種不同群體遺傳分化程度的研究[23]、河流中放流類型魚類的混合比例分析[24]、種類的鑒別[25]、野生銀鯽克隆的鑒別及親子代的遺傳特性分析[13-14]、鯉鯽雜交種的遺傳分析[26]等.

鯽魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，也是重要的育種材料.鯽魚中有染色體數(shù)為100的二倍體種群和染色體數(shù)為150左右的三倍體種群.本研究通過紅細胞大小判定采集自天津市獨流減河的野生鯽魚屬于二倍體，再對其進行遺傳多樣性的檢測分析.同工酶在魚類的肌肉、肝臟、腎、心、腦、鰓等組織中經(jīng)常會出現(xiàn)相同但電泳帶遷移率不同或遷移率相同但電泳帶濃度不同的現(xiàn)象，表現(xiàn)出組織特異性[23].本研究依據(jù)同工酶的電泳帶數(shù)量、位置、濃度等可以看出二倍體野生鯽魚同工酶的表達有明顯的組織特異性，GPI-1*、GPI-2*、IDH-1*和 IDH-2*只在肝臟中表達，IDH-3*和GPI-3*只在肌肉中表達.

在應(yīng)用同工酶檢測技術(shù)分析魚類的遺傳多樣性研究中，多態(tài)基因座位比例、單位基因座位的等位基因數(shù)、平均雜合度等是衡量遺傳多樣性的主要指標(biāo)[11-12].其中平均雜合度是度量遺傳變異的最簡單直接、最富信息量的方法[11].一般認為貝類的平均雜合度為0.147，甲殼類的為0.043，魚類的為0.059，水生哺乳類為0.034[27].Smith等[28]報道了89種海水魚類的平均雜合度為0.060.汪亞平等[18]檢測出洪湖和洞庭湖鯽魚的平均雜合度分別為0.0702和0.1048.本研究分析了天津市獨流減河二倍體野生鯽魚的8種同工酶，檢測出18個基因座位，其中8個有變異，平均雜合度觀察值為0.0715，平均雜合度預(yù)期值為0.0767，高于以往研究中魚類的0.059[27]以及89種海水魚的0.060[28]，這些結(jié)果表明天津市獨流減河二倍體野生鯽魚的遺傳多樣性較豐富.

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