周瑋，張津源，王祖峰，宋國斌

(1．大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧大連116023;2．大連寶發(fā)海珍品有限公司，遼寧大連116021)

20世紀70年代，世界衛(wèi)生組織宣布硒是生物體必需的微量元素，2000年，中國營養(yǎng)學會提出中國居民正常飲食中硒的攝入量嚴重不足［1］，此后通過富硒技術(shù)提高食品中的硒含量便成為中國國民補硒的主要渠道。富硒技術(shù)也稱作微量元素硒的生物有機化技術(shù)，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，對克氏原螯蝦Procambarus clarkii的富硒研究，使蝦肉中的硒含量提高了200%［2］;而對大西洋鮭 Salmon salar、日本沼蝦Macrobrachium nipponense的研究表明，硒能夠顯著提高其生長速度。刺參Apostichopus japonicus作為中國北方海珍品養(yǎng)殖的主要種類之一，對其進行富硒技術(shù)研究，具有廣闊的市場前景。

目前，水產(chǎn)動物富硒技術(shù)中使用的硒源主要有兩類，即有機硒和無機硒。其中有機硒主要通過無機硒生物合成獲得，價格較為昂貴，以硒代蛋氨酸為主;無機硒來源較廣且相對便宜，主要為硒酸鈉和亞硒酸鈉，二者均能起到一定的富硒效果。但過量的硒化合物也會導致動物體內(nèi)自由基產(chǎn)生，從而對動物機體造成傷害［3-4］。另外，不同硒化合物對水產(chǎn)動物的毒性也不同［5-7］，Baumann 等［8］對黑鱸Micropterus salmodies和藍鰓太陽魚Lepomis macrochirus的研究表明，無機硒毒性是有機硒的3～5倍。而水產(chǎn)動物對無機硒的敏感性也因種類的不同有較大差異，以亞硒酸鈉為例，魚類對其敏感程度相對較差，其中斑馬魚 Brachydanio rerio［9］的96 h半致死濃度 (96 h LC50)為16．67 mg/L，泥鰍Misgurnus anguillicaudatus［10］的 96 h LC50為 44．8 mg/L，而海灣扇貝Argopecten irradiams［11］、大型水蚤Daphnia magna［12］的 96 h LC50僅 為 1．20、1．05 mg/L。關(guān)于硒對刺參的毒性，僅見孫振興等［13］進行了亞硒酸鈉對幼參的毒性研究，而有關(guān)不同硒化合物對刺參的毒性研究目前尚未見報道。本研究中，從富硒技術(shù)角度出發(fā)，選取常用的硒代蛋氨酸、亞硒酸鈉和硒酸鈉3種硒化合物，針對3種規(guī)格的刺參進行急性毒性試驗，研究了不同硒化合物對刺參的96 h LC50和安全濃度，旨在為富硒技術(shù)用于刺參養(yǎng)殖時的硒源選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗刺參取自大連寶發(fā)海珍品有限公司的海參養(yǎng)殖池塘，體質(zhì)量分別為(11．1±2．7)、(21．3±3．0)、(51．9 ±3．7)g，分別記為 10、20、50 g組，每組刺參200頭，分別置于20 m3水池中暫養(yǎng)3 d后進行試驗。

試驗藥品有硒代蛋氨酸、亞硒酸鈉和硒酸鈉(均為分析純，成都格雷西亞化學技術(shù)有限公司)，分別用雙蒸水配制母液，試驗時用微量移液器將所需藥品的母液加入海水中稀釋至所需濃度。

1.2 方法

參考寇氏法設(shè)計預試驗和正式試驗，試驗海水為沙濾海水，試驗期間水溫為18℃，鹽度為28。

1．2．1 預試驗 根據(jù)3種刺參規(guī)格 (10、20、50 g)、3種硒化合物 (亞硒酸、硒代蛋氨酸、硒酸鈉)分別設(shè)置預試驗，每組放4頭刺參，采用接觸試毒法，觀察96 h，確定刺參全部死亡的劑量和零死亡的劑量。

1．2．2 急性毒性試驗 按照刺參規(guī)格和硒化合物的不同分別設(shè)計正式試驗。對每種規(guī)格的刺參進行3種硒化合物的急性毒性試驗，亞硒酸鈉、硒酸鈉均設(shè) 0(空白對照)、0．06、0．13、0．25、0．50、1．00 mg/L 6個濃度組，硒代蛋氨酸設(shè)0(空白對照)、0．13、0．25、0．50、1．00、2．00 mg/L 6 個濃度組，每個試驗設(shè)3個重復。硒化合物濃度的設(shè)定是將預試驗結(jié)果得出的最高劑量和最低劑量換算為常用對數(shù)，采用Korbor法按等對數(shù)間距設(shè)置。試驗前72 h停止投喂，采用靜水法并微量充氣，每組放10頭刺參，試驗時間為96 h，每天觀察3次刺參的中毒表現(xiàn)和死亡情況，并及時撿出死亡刺參，記錄死亡數(shù)量和中毒癥狀。

1.3 指標的測定

根據(jù)試驗結(jié)果計算 lg LC50，查反對數(shù)表得LC50及95%置信區(qū)間 (X)，計算公式為

其中:d為相鄰劑量比值的對數(shù);Xi、Xi+1分別為相鄰兩組的劑量對數(shù);Pi+1、Pi分別為相鄰兩組的動物死亡百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參的中毒癥狀

刺參對硒代蛋氨酸、亞硒酸鈉、硒酸鈉的中毒反應基本相同。在低劑量組，48 h內(nèi)刺參的活動情況與對照組沒有明顯差別，48 h后其活動及反應能力逐漸遲緩，隨著中毒時間的延長，刺參部分管足喪失吸附能力并出現(xiàn)排臟現(xiàn)象，繼而極少數(shù)個體喪失活動能力，甚至死亡;在高劑量組，刺參的反應相對敏感，具體表現(xiàn)為24 h后大部分刺參個體行動遲緩，48 h后管足開始喪失吸附能力，繼而出現(xiàn)排臟現(xiàn)象，隨后刺參體表開始起泡、潰爛，甚至死亡。

2.2 硒代蛋氨酸對刺參的急性毒性試驗

從表1可見:隨著硒代蛋氨酸濃度的升高，3個規(guī)格組刺參96 h的死亡率也隨之升高，最高濃度組死亡率均為100%;3種規(guī)格刺參的最低濃度組均有刺參死亡，其中20、50 g組刺參的死亡率均為6．7%，10 g組的死亡率為10%;而3種規(guī)格的空白對照組均未出現(xiàn)死亡。根據(jù)公式計算得出3種規(guī)格刺參的96 h LC50和安全濃度。從表2可見，3種規(guī)格刺參中50 g組的96 h LC50和安全濃度均最高，20 g組次之，10 g組均最低。

表1 硒代蛋氨酸對刺參的致死率Tab.1 Mortality of sea cucumber Apostichopus japonicus exposed to selenomethionine

表2 硒代蛋氨酸對刺參的半致死濃度、安全濃度Tab.2 96 h LC50，and safe concentration of selenomethionine in sea cucumber

2.3 亞硒酸鈉對刺參的急性毒性試驗

從表3可見:隨著亞硒酸鈉濃度的升高，3個規(guī)格組刺參96 h的死亡率也隨之升高，10 g組最高濃度時，刺參的死亡率為96．7%，20、50 g組最高濃度時死亡率為100%;50 g組最低濃度時無刺參死亡，而20、10 g組最低濃度時均有刺參死亡，死亡率均為10%;而3種規(guī)格的空白對照組均未出現(xiàn)死亡。從表4可見:3種規(guī)格刺參中50 g組的96 h LC50和安全濃度均最高，10 g組均最低。

表3 亞硒酸鈉對刺參的致死率Tab.3 Mortality of sea cucumber Apostichopus japonicus in the acute toxicity experiment of sodium selenite

表4 亞硒酸鈉對刺參的半致死濃度、安全濃度Tab.4 96 h LC50，and safe concentration of sodium selenite in sea cucumber

2.4 硒酸鈉對刺參的急性毒性試驗

從表5可見:隨著硒酸鈉濃度的升高，3個規(guī)格組刺參96 h的死亡率也隨之升高，10 g組最高濃度時刺參的死亡率為100%，20、50 g組的死亡率分別為96．7%、90%;50 g組最低濃度時未出現(xiàn)刺參死亡，而20、10 g組最低濃度時均有刺參死亡，死亡率均為10%;3種規(guī)格的空白對照組均未出現(xiàn)死亡。從表6可見:3種規(guī)格刺參中50 g組的96 h LC50和安全濃度均最高，10 g組均最低。

3 討論

3.1 3種藥物對刺參的毒性比較

本試驗設(shè)計條件下，硒代蛋氨酸對刺參的96 h LC50高于其余兩種硒化合物，這與郝麗娟等［14］對水產(chǎn)動物的報道相符。根據(jù)GBT-22487—2008水產(chǎn)動物接觸致毒急性毒性劑量分級:LC50＜1 mg/L為極毒，LC50=1～100 mg/L為劇毒，LC50=100～1000 mg/L為中等毒，LC50=1000～10 000 mg/L為低毒，LC50＞10 000 mg/L為實際無毒。本研究中，3種硒化合物對各種規(guī)格的刺參均為極毒。

不同種類的硒化合物對水產(chǎn)動物的毒性大小，因生物種類而異。高世榮等［9］對斑馬魚的研究表明，Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)的 96 h LC50分別為16．67、39．33 mg/L;Na2SeO3和 Na2SeO4對黑斑蛙蝌蚪的 96 h LC50分別為 33．5、94．8 mg/L［15］，均表明硒酸鈉的毒性小于亞硒酸鈉。鄧岳松等［16］研究表明，亞硒酸鈉對尼羅羅非魚的急性毒性約是硒代蛋氨酸的2倍。本研究結(jié)果表明:3種硒化合物的毒性為硒代蛋氨酸＜硒酸鈉＜亞硒酸鈉，且亞硒酸鈉的毒性約是硒代蛋氨酸的2倍，與上述結(jié)果相類似。同時可以看出，刺參對亞硒酸鈉的敏感程度大于斑馬魚、尼羅羅非魚和黑斑蛙蝌蚪，對硒酸鈉的敏感程度大于斑馬魚和黑斑蛙蝌蚪，對硒代蛋氨酸的敏感程度大于尼羅羅非魚。刺參對硒的敏感程度較高，且硒代蛋氨酸的毒性約為其余兩種無機硒的1/3～1/2，因此，考慮到毒性因素，在富硒海參生產(chǎn)中，推薦使用硒代蛋氨酸作為硒源。

表5 硒酸鈉對刺參的致死率Tab.5 Mortality of sea cucumber Apostichopus japonicus in the acute toxicity experiment of sodium selenate

表6 硒酸鈉對刺參的半致死濃度、安全濃度Tab.6 96 h LC50，and safe concentration of sodium selenate in sea cucumber

3.2 藥物對刺參的安全濃度評價

硒能夠提高水產(chǎn)動物的代謝水平及抗病力，但是水環(huán)境中過量的硒也會對刺參產(chǎn)生毒害作用，影響刺參的生長、發(fā)育和刺參食品的安全。按照Marino等［17］推薦的最大容許濃度公式 MPC=96 h LC50×0．01，計算得到硒代蛋氨酸對10、20、50 g組刺參的 MPC 分別為 0．006 39、0．007 41、0．007 95 mg/L，亞硒酸鈉對3組刺參的MPC分別為 0．002 75、0．002 99、0．003 24 mg/L，硒酸鈉對3 組 刺 參的 MPC 分 別 為 0．003 05、0．003 46、0．003 68 mg/L，與中國現(xiàn)行海水養(yǎng)殖水質(zhì)標準NY5052—2001［18］中硒≤0．02 mg/L 的標準值相比，3種藥物的MPC均小于該標準值，說明與其他水產(chǎn)動物相比，刺參對硒的耐受性較低，這可能與海參的生理結(jié)構(gòu)簡單、生物地位較低有關(guān)。

由于在富硒海參生產(chǎn)過程中，需要將硒添加劑混入飼料中，而飼料中硒化合物在水中的溶解度往往較高［19］，因此，在硒添加飼料的研發(fā)過程中，應采用添加黏合劑和充分糊化等方式，盡可能防止硒化合物流失。

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