張振國，姜巨峰，孫志景，郝爽，吳會民，馮守明

(天津市水產(chǎn)研究所天津市觀賞魚技術(shù)工程中心，天津300221)

長絲鱸Osphronemas goramy又名絲足鱸，隸屬于長絲鱸科Osphrone midae、長絲鱸魚屬Osphronemas，在中國俗稱紅招財、財神魚、招財魚，是熱帶淡水魚類，兼具食用價值和觀賞價值［1-4］。長絲鱸尾鰭、臀鰭和全身為金黃色，有金屬光澤，在光照下能散發(fā)出金黃色的光芒。因其腹鰭有2條較硬的長絲延伸至尾鰭，故得名長絲鱸，在觀賞魚市場具有廣闊的養(yǎng)殖前景。長絲鱸的規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益，但病害頻發(fā)，嚴重制約著長絲鱸養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

目前，關(guān)于長絲鱸的研究主要集中在育苗、養(yǎng)殖和增加其自身觀賞性等方面，在病害控制方面的研究較少，僅見對長絲鱸紅斑?。?］和結(jié)節(jié)?。?］的研究報道。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，長絲鱸“突眼病”是一種較為常見的疾病，該病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為兩眼外凸，眼球周圍紅腫、發(fā)炎，猶如龍眼核，魚體有點狀紅斑，偶爾會隨伴全身性水腫，并且死亡率很高。目前對魚類“突眼病”的研究還很少，僅見對金魚［7］和羅非魚［8］“突眼病”的研究報道。本研究中，對某觀賞魚養(yǎng)殖場長絲鱸“突眼病”的致病菌進行了研究，從自然發(fā)病的長絲鱸腎臟內(nèi)分離出優(yōu)勢生長菌株，經(jīng)人工回歸感染試驗，研究該菌株的致病力，通過對其主要理化特性、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等分析對該菌株進行鑒定，同時對病原菌進行藥物敏感性試驗，研究結(jié)果可為防治長絲鱸“突眼病”提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用患病長絲鱸于2013年取自天津市某觀賞魚養(yǎng)殖場。

儀器與試劑主要有:LB培養(yǎng)基、藥敏紙片、梅里埃全自動細菌鑒定儀、生化培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1．2．1 癥狀的觀察 先觀察魚體的活力、游動能力、溜邊等情況，再觀察體表、頭部、鰭部等有無潰爛、出血等，然后剪下鰓蓋觀察鰓絲情況，最后解剖，觀察肝臟、腎臟和腸道等有無病變。

1．2．2 細菌的分離與培養(yǎng) 用體積分數(shù)為70%的酒精棉將皮膚表面消毒，解剖后，用無菌接種環(huán)取肝臟和腎臟，劃線接種于LB培養(yǎng)基平板上，置于35℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;挑取優(yōu)勢菌落，重新劃線接種于LB培養(yǎng)基平板上，于35℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1．2．3 生化鑒定 采用梅里埃全自動細菌鑒定儀與生化微量反應(yīng)管相結(jié)合的方法對純化的CSL1菌落進行生化鑒定。

1．2．4 16S rRNA基因序列的測定與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 (1)PCR模板DNA的制備。將菌株CSL1于35℃液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，按照細菌基因組DNA提取試劑盒 (天根生化科技有限公司)的方法提取基因組DNA。

(2)序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。利用細菌16SrRNA通用引物:正向引物 F(5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3')和反向引物R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3')擴增目的基因。引物由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成，以分離菌株CSL1的基因組DNA為模板，采用PCRmixed試劑盒 (天根生化科技有限公司)進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序:95℃下變性3 min;94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進行32個循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min，4℃下保存。取6 μL產(chǎn)物在含Goldview染色劑的15 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后將凝膠放入成像系統(tǒng)，觀察結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程 (上海)股份有限公司進行序列測定。將菌株CSL1的16S rRNA基因序列與Gen-Bank中已知核酸序列進行比對，選取同源性比較高的序列，用ClusterX軟件進行比對，使用Mega 4．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1．2．5 藥敏試驗 藥敏試驗采用 KB紙片法［9］，將菌液濃度調(diào)至1×108cfu/mL，吸取菌液200 μL，在無菌條件下用涂布棒均勻涂于LB培養(yǎng)基平板上。取藥敏紙片貼于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑。依據(jù)《現(xiàn)代診斷學(xué)手冊》［10］中藥敏試驗抑菌圈直徑的判定標準，判斷致病菌對藥物的敏感程度。

1．2．6 人工感染試驗 采用注射、劃傷浸泡和浸泡3種感染方式進行人工回歸感染試驗，每組6尾魚，每種感染方式設(shè)1個對照組。注射感染組菌濃度為1×108cfu/mL，注射劑量為0．2 mL/尾;劃傷浸泡感染組采用滅菌手術(shù)刀片劃傷皮膚，在濃度為1×108cfu/mL的菌液中浸泡30 min;浸泡感染組直接在濃度為1×108cfu/mL的菌液里浸泡30 min。試驗進行兩周，每天觀察并記錄魚的發(fā)病和死亡情況［11］，并進行細菌分離和鑒定，方法同 “1．2．2”和 “1．2．3”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型癥狀

發(fā)病長絲鱸臨床癥狀主要表現(xiàn)為兩眼外凸，眼球周圍紅腫、發(fā)炎，魚體有紅斑 (圖1)，偶爾會隨伴全身性的水腫。

圖1 患“突眼病”長絲鱸的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of giant gourami Osphronemas goramy

2.2 細菌形態(tài)特征

從患“突眼病”長絲鱸腎臟中分離到1株優(yōu)勢菌，命名為CSL1，該菌株在LB培養(yǎng)基上可見有圓形、隆起、光滑、濕潤的菌落，直徑約2 mm。

2.3 細菌生化鑒定

對純化的菌落采用梅里埃全自動生化鑒定儀鑒定，用普通微量生化管進行補充鑒定。其中生化項目葡萄糖產(chǎn)氣、硫化氫、七葉苷和VP試驗由微量生化管補充得出，其他生化項目由全自動細菌鑒定儀得出 (表1)。根據(jù)該菌株的形態(tài)特征和主要理化特征，初步鑒定為豚鼠氣單胞菌。

2.4 藥敏試驗

在19種抗菌藥物中，CSL1菌株對左氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、吡哌酸8種藥物高度敏感，約占藥物總數(shù)的42．1%;對阿齊霉素、新霉素和強力霉素3種藥物中度敏感，約占藥物總數(shù)的15．8%;對新生霉素、萘啶酸、氨卞青霉素、青霉素、阿莫西林、甲氧卞啶、鏈霉素、復(fù)方新諾明8種藥物不敏感，約占藥物總數(shù)的42．1%(表2)。

表1 菌株CSL1的生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical identification of strain CSL1

表2 菌株CSL1的藥物敏感試驗結(jié)果Tab.2 Antibiotics sensitive test of strain CSL1

2.5 系統(tǒng)進化樹

CSL1菌株的16S rRNA基因序列長度為1417 bp(圖2)，將菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上通過Blast進行同源性比對，結(jié)果檢索出為氣單胞菌屬的16S rRNA基因序列，選取同源性較高的序列采用鄰接法構(gòu)建菌株系統(tǒng)進化樹 (圖3)，CSL1在系統(tǒng)進化樹上與豚鼠氣單胞菌 (登錄號:KF835804、X60408、KJ650079)聚為一支。結(jié)合生理生化反應(yīng)，確定從患“突眼病”的長絲鱸體內(nèi)分離的菌株為豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviae。

圖2 菌株CSL1 16S rRNA基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene in strain CSL1

2.6 人工感染試驗結(jié)果

注射組，5 d后開始有個別魚死亡并出現(xiàn)典型癥狀，14 d后死亡率為66．7%，而注射對照組魚無死亡;劃傷浸泡組同樣出現(xiàn)典型癥狀，死亡率為100%，而劃傷對照組死亡率為16．7%，沒有出現(xiàn)與感染組相同的癥狀，可能與劃傷比較嚴重有關(guān);浸泡感染組和浸泡對照組魚無死亡 (表3)。

從具有典型癥狀的病魚腎臟中分離出同樣形態(tài)的菌株，經(jīng)鑒定為豚鼠氣單胞菌，證實豚鼠氣單胞菌為引起長絲鱸“突眼病”的病原菌。

圖3 CSL1 16S rRNA基因序列發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of CSL1

表3 人工感染試驗結(jié)果Tab.3 Results of artificial infection test in strain CSL1

3 討論

關(guān)于長絲鱸的疾病報道相對較少，僅有諾卡氏菌引起長絲鱸紅斑病以及結(jié)節(jié)病的報道。引起魚類“突眼病”的因素較多，如營養(yǎng)不良、氨氮過高，以及病毒、細菌的感染等。對于由細菌引起的魚類“突眼病”的研究較少，僅見由魯氏不動桿菌引起的金魚“突眼病”和由假單胞菌屬引起的紅羅非魚“突眼病”的報道，但與長絲鱸“突眼病”的病原菌不相同，由此可見，多種細菌感染均可以引起魚類“突眼病”，不同的病原菌可以導(dǎo)致相同的癥狀出現(xiàn)，這也是魚病診斷比較困難的原因之一。

豚鼠氣單胞菌是一種條件性致病菌，宿主范圍比較廣，危害多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物。魚類主要癥狀表現(xiàn)為敗血癥，樊海平等［12］報道了歐洲鰻鱺敗血癥，李小波等［13］報道了豐產(chǎn)鯽細菌性敗血癥，曹海鵬等［14］報道了西伯利亞鱘魚細菌性敗血癥。此外，還能引起鯉豎鱗病［15］和出血?。?6］、鰱鳙打印?。?7］、虹鱒皮膚潰爛?。?8］、南方鲇體表潰瘍?。?9］、觀賞金魚出血?。?0］等。Jagoda 等［21］從淡水觀賞魚體內(nèi)分離到氣單胞菌屬，其中包括豚鼠氣單胞菌。豚鼠氣單胞菌也可引起其他水產(chǎn)動物的疾病，如蝦［22-23］、甲魚［24］、中華鱉［25］、中華絨螯蟹［26］等。豚鼠氣單胞菌不僅可以感染水產(chǎn)動物，還可感染哺乳動物和人類，人感染豚鼠氣單胞菌可患急性腸胃炎，引起腹瀉［13］。

藥物敏感試驗結(jié)果顯示，在常用的19種抗菌藥物中，豚鼠氣單胞菌對8種藥物敏感性高，所以使用左氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、吡哌酸效果較好，是治療因豚鼠氣單胞菌引起的長絲鱸“突眼病”的有效藥物。從金魚體內(nèi)分離到的豚鼠氣單胞菌對四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素等高度敏感［20］，從歐洲鰻鱺體內(nèi)分離到的豚鼠氣單胞菌對慶大霉素、氟哌酸等高度敏感［12］，從虹鱒體內(nèi)分離的豚鼠氣單胞菌對氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明等藥物高度敏感［18］。不同魚體內(nèi)分離到的豚鼠氣單胞菌對藥物的敏感性也不盡相同，可能與豚鼠氣單胞菌的宿主、地理分布和試驗中選擇的藥物種類等有關(guān)，但大部分豚鼠氣單胞菌菌株對慶大霉素都高度敏感，因此，慶大霉素是治療由豚鼠氣單胞菌引起的各種養(yǎng)殖魚類相關(guān)疾病的普適藥物。但養(yǎng)殖生產(chǎn)中用藥需要進一步考慮用藥濃度、用藥方式和環(huán)境污染等問題。

人工感染試驗結(jié)果顯示，劃傷浸泡感染組的死亡率最高，注射感染組死亡率略低于劃傷浸泡組，直接浸泡感染組無感染現(xiàn)象發(fā)生。健康長絲鱸體表無破損，浸泡時間相對短，較難引發(fā)感染。本研究中分析了長絲鱸“突眼病”的癥狀，并經(jīng)過細菌分離、生化鑒定、16S rRNA分子鑒定和人工感染試驗，確認豚鼠氣單胞菌為引起長絲鱸“突眼病”的病原菌，并對該病原菌進行了藥敏試驗。此研究填補了長絲鱸“突眼病”研究的空白，為防治長絲鱸“突眼病”提供了參考。

［1］魏于生，齊彩霞，魏志宇，等．長絲鱸的生物學(xué)及其人工繁殖［J］．淡水漁業(yè)，2002，32(2):21-23．

［2］白東清，魏東，馬樹敏，等．長絲鱸血液部分生理生化指標測定［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(2):755-757．

［3］陳永樂，朱新平，劉毅輝．絲足鱸的形態(tài)特征與核型［J］．水產(chǎn)學(xué)報，2002，26(4):375-378．

［4］孫硯勝，孫向軍，史東杰，等．紅招財工廠化養(yǎng)殖的技術(shù)及效益分析［J］．水產(chǎn)科技情報，2010，37(1):50-52．

［5］林偉，彭新亮，楊治國．招財魚紅斑病病原——諾卡氏菌的分離與鑒定［J］．信陽農(nóng)業(yè)高等專科學(xué)校學(xué)報，2012，22(2):99-101．

［6］徐曉麗，李賀密，邵蓬，等．絲足鱸致病性諾卡氏菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］．水產(chǎn)科學(xué)，2013，32(11):657-661．

［7］鄒文政，紀榮興，莫英軍．金魚“突眼病”病原的初步研究［J］．集美大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，8(1):12-15．

［8］紀榮興，黃少濤，鄒文政，等．紅羅非魚“突眼病”病原的初步研究［J］．集美大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2000，5(2):29-33．

［9］徐叔云，卞如濂，陳修．藥理實驗方法學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1651-1654．

［10］王淑娟．現(xiàn)代診斷學(xué)手冊［M］．北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995:511-522．

［11］徐祥，李華，葉仕根，等．雜交鱘嗜水氣單胞菌病的組織病理學(xué)研究［J］．大連海洋大學(xué)學(xué)報，2014，29(3):227-231．

［12］樊海平，曾占壯，余培建，等．由豚鼠氣單胞菌引起的歐洲鰻鱺敗血癥［J］．水產(chǎn)學(xué)報，1999，23(3):313-318．

［13］李小波，黃文芳．豐產(chǎn)鯽細菌性敗血病的研究:Ⅰ．病原分離與鑒定［J］．微生物學(xué)通報，2003，30(5):56-60．

［14］曹海鵬，楊先樂，王玉潔，等．鱘源致病性豚鼠氣單胞菌的分離及其生長特性［J］．動物學(xué)雜志，2007，42(6):1-6．

［15］安利國，傅榮恕，邢維賢，等．鯉豎鱗病病原及其疫苗的研究［J］．水產(chǎn)學(xué)報，1998，22(2):136-142．

［16］韓英，劉敏，姜艷平．鯉魚出血病病原的研究和藥敏試驗［J］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，36(5):593-597．

［17］陳翠珍，張曉君，房海，等．鰱鳙打印病豚鼠氣單胞菌主要特性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22(5):455-459．

［18］丁雷，岳永生，宋憬愚．虹鱒皮膚潰爛病的病原菌研究［J］．淡水漁業(yè)，2002，32(3):28-30．

［19］汪開毓，肖丹，賀揚，等．南方鲇(Silurus meridionalis)豚鼠氣單胞菌溶血素的分離、純化與致病性研究［J］．海洋與湖沼，2012，43(6):1122-1127．

［20］許信剛，伊嵐，王高學(xué)．觀賞金魚豚鼠氣單胞菌的分離鑒定及防治［J］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15(1):40-42．

［21］Jagoda S S，Wijewardana T G，Arulkanthan A，et al．Characterization and antimicrobial susceptibility of motile aeromonads isolated from freshwater ornamental fish showing signs of septicaemia［J］．Dis Aquat Organ，2014，109(2):127-137．

［22］樊海平，孟慶顯，俞開康．中國對蝦敗血病病原菌(氣單胞菌)的致病性與生物學(xué)性狀［J］．水產(chǎn)學(xué)報，1994，18(1):32-38．

［23］Saejung C，Hatai K，Sanoamuang L．The in-vitro antibacterial effects of organic salts，chemical disinfectants and antibiotics against pathogens of black disease in fairy shrimp of Thailand［J］．J Fish Dis，2014，37(1):33-41．

［24］余旭平，馬有智．甲魚病原性豚鼠氣單胞菌的分離鑒定［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報，1997，17(5):460-462．

［25］孫紅祥，舒妙安．中華鱉溶血性腹水病病原菌的分離鑒定及藥敏性研究［J］．浙江大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2000，26(2):177-180．

［26］徐海圣，黃立峰，王淑霞．中華絨螯蟹豚鼠氣單胞菌的分離和鑒定［J］．浙江大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2001，27(6):677-681．