韓冰，楊洪波，王荻，盧彤巖

(1．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070;2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306)

松浦鏡鯉Cyprinus carpio Songpu是中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所在德國鏡鯉選育系F4代基礎(chǔ)上，采用混合選擇方法選育3代后培育出的新品種，具有體型好、背部高而厚、生長快、抗寒力強、繁殖力高、體表基本無鱗等特點，是中國當(dāng)今淡水名優(yōu)品種重點開發(fā)對象之一。

復(fù)方磺胺甲噁唑 (Sulfonamides，SAs)又名復(fù)方新諾明，是磺胺類藥物磺胺甲噁唑 (Sulfamethoxazole，SMZ)與磺胺增效劑甲氧芐啶 (Trimethoprim，TMP)按5∶1的比例混合組成的制劑。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性大、性質(zhì)穩(wěn)定、吸收迅速、價格低廉等優(yōu)點，對水產(chǎn)動物的癤瘡病、細菌性爛鰓病、豎鱗病、打印病、細菌性敗血癥等治療效果良好，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中。目前，關(guān)于復(fù)方磺胺甲噁唑在水產(chǎn)動物中的藥動學(xué)研究不多［1-6］，并且細菌菌株對磺胺類藥物容易產(chǎn)生耐藥性已經(jīng)得到廣泛認同［7-8］。攝食含磺胺類藥物殘留的食物后會在人體內(nèi)蓄積，當(dāng)藥物蓄積到一定濃度時會對人體機能產(chǎn)生損害，可產(chǎn)生過敏、尿結(jié)晶、造血紊亂和致癌等毒性反應(yīng)［9-10］。因此，磺胺類藥物在動物源性食品中的殘留越來越受到重視。中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準NY 5070—2002《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》規(guī)定，水產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留的最高限量為50 μg/kg，磺胺類藥物殘留的總量不得超過100 μg/kg。本研究中，對復(fù)方磺胺甲噁唑在松浦鏡鯉體內(nèi)的藥動學(xué)以及殘留消除規(guī)律進行研究，旨在了解用藥效果與用藥安全之間的關(guān)系，科學(xué)地指導(dǎo)松浦鏡鯉養(yǎng)殖中復(fù)方磺胺甲噁唑的合理使用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用松浦鏡鯉體質(zhì)量為 (89．57±13．91)g，由黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗基地提供。試驗在自動循環(huán)水魚缸中進行，試驗期間持續(xù)充氣，水溫保持在 (20±0．5)℃。試驗魚暫養(yǎng)7 d，期間投喂全價基礎(chǔ)飼料。

試驗藥品有:甲氧芐啶標(biāo)準品，含量為99．5%(德國 Dr．Ehrenstorfer，批號 10121);磺胺甲噁唑標(biāo)準品 (德國Dr．Ehrenstorfer，批號10405)含量為99．5%;復(fù)方磺胺甲噁唑粉 (北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司，批號20120506)100 g中含8．33 g SMZ 和 1．67 g TMP;二氯甲烷(A．R)、乙腈(HPLC)、冰乙酸(HPLC)、正己烷(HPLC)等均為市售分析純。

試驗儀器主要有戴安U-3000高效液相色譜儀 (ThermoFisher公司)、3K15離心機 (Sigma公司)、FJ 200-S調(diào)速混勻器 (上海標(biāo)準模型廠)、T-214電子天平 (賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、MD200-2氮吹儀 (杭州奧盛儀器有限公司)。

1.2 方法

1．2．1 給藥方法與樣品的采集

(1)藥動學(xué)試驗。以有效成分50 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量單次對松浦鏡鯉口灌復(fù)方磺胺甲噁唑粉混懸液(30%乙醇配制)，于停藥后第0．25、0．50、0．75、1．0、1．5、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h隨機選取6尾試驗魚，采集血 (經(jīng)3‰肝素鈉抗凝后離心吸取血漿)、肝胰臟、腎、肌肉組織樣品，編號后保存于冰箱 (-20℃)中備用。

(2)殘留量試驗。以有效成分50 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量，每天一次，連續(xù)5 d對松浦鏡鯉口灌復(fù)方磺胺甲噁唑粉混懸液 (用30%乙醇配制)，于停藥后第1天至第15天每天隨機選取6尾試驗魚，采集血 (經(jīng)3‰肝素鈉抗凝后離心吸取血漿)、皮、肌肉等可食用組織，編號后保存于冰箱 (-20℃)中備用。

1．2．2 標(biāo)準儲備液的配制 準確稱取甲氧芐啶和磺胺甲噁唑標(biāo)準品各0．004 g，分別溶于20 mL流動相中，各自配制成200 μg/mL的標(biāo)準儲備液，于4℃下避光保存。使用時用流動相稀釋成所需濃度的標(biāo)準溶液。

1．2．3 樣品的前處理

(1)血漿樣品。從冰箱 (-20℃)中取出血漿樣品，于室溫下自然解凍后搖勻，精確吸取200 μL于2 mL離心管中，然后加入1 mL甲醇，震蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min，吸取上清液于10 mL離心管中。剩余殘渣再加入1 mL甲醇重復(fù)提取，震蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min，合并上清液于上述離心管中，重復(fù)此步驟一次。將含有3次提取液的10 mL離心管于40℃下用氮氣吹干，殘渣用1 mL流動相溶解，加入1 mL正己烷除脂，震蕩2 min，以8000 r/min離心3 min，下層液過0．22 μm有機相濾頭后待測。

(2)肝胰臟、腎、皮、肌肉組織樣品。準確稱取1 g組織放入50 mL離心管中，加入4 mL二氯甲烷，以15 000 r/min勻漿30 s，再用3 mL二氯甲烷清洗刀頭30 s，合并提取液于上述離心管中，震蕩2 min，以8000 r/min離心5 min，吸取全部上清液于15 mL離心管中。剩余殘渣加入4 mL二氯甲烷重復(fù)提取，震蕩2 min，以8000 r/min離心5 min，合并上清液于上述15 mL離心管中，重復(fù)此步驟一次。將含有3次提取液的15 mL離心管于40℃下用氮氣吹干，殘渣用1 mL流動相溶解，加入1 mL正己烷除脂，震蕩2 min，以5000 r/min離心3 min，下層液過0．22 μm有機相濾頭后待測。

1．2．4 色譜條件 色譜柱為 Waters Spherisorb ODS2-C18柱 (4．6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫為30℃;流動相為乙腈∶1%乙酸溶液∶0．4%乙酸銨溶液 =20∶40∶40(體積比)，流速為1．0 mL/min;進樣量為20 μL，紫外檢測波長為270 nm。

1．2．5 標(biāo)準曲線的繪制 準確移取甲氧芐啶標(biāo)準儲備液，依次稀釋成 100、50、10、5、1、0．5、0．1、0．05 μg/mL的標(biāo)準工作液;準確移取磺胺甲噁唑標(biāo)準儲備液，依次稀釋成100、50、10、5、1、0．5、0．1、0．05 μg/mL 的標(biāo)準工作液。過0．22 μm有機相濾頭后通過HPLC-UV進行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，分別求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1．2．6 回收率和精密度的測定 每種組織 (血漿、皮、肝胰臟、腎、肌肉)的回收率試驗均設(shè)置3個濃度組，每個濃度組組織中藥物的添加水平分別為Ⅰ (1 mg/kg或 mg/L TMP+5 mg/kg或mg/L SMZ)、Ⅱ (2 mg/kg或 mg/L TMP+10 mg/kg或mg/L SMZ)、Ⅲ (10 mg/kg或mg/L TMP+50 mg/kg或mg/L SMZ)。取1 g空白組織，各組添加標(biāo)準液的總體積均為1 mL，每種濃度設(shè)置3個重復(fù)，靜置一段時間后，按照樣品前處理的方法處理后進行測定。

各試驗組在同一天內(nèi)分別測定3次，在一周內(nèi)不同天測定3次，計算不同濃度下樣品的相對標(biāo)準偏差，計算日內(nèi)和日間精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準曲線、藥-時曲線和消除曲線采用Microsoft Excel軟件繪制;藥動學(xué)模型擬合及參數(shù)計算使用3P97軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準曲線與最低檢測限

應(yīng)用本試驗建立的檢測方法，TMP和SMZ的最低檢測限均為0．01 mg/L。以標(biāo)準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準曲線。結(jié)果表明:TMP和SMZ在0．05～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，經(jīng)計算其相關(guān)指數(shù) (R2)均為0．9999，線性回歸方程分別為 y=0．4218x-0．0069和 y=1．0512x-0．0811。

2.2 回收率與精密度

本試驗條件下，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個質(zhì)量濃度添加水平下，TMP和SMZ在各組織中的平均回收率分別為73% ～84%、82% ～92%(表1)。測得的日內(nèi)精密度為2．27% ±0．69%，日間精密度為4．02% ±0．77%。

2.3 藥時曲線與主要藥動學(xué)參數(shù)

TMP在鯉血漿、肌肉中的藥時關(guān)系符合一級吸收一室開放模型，其代謝方程分別為

TMP在肝胰臟、腎中的藥時關(guān)系符合一級吸收二室開放模型，其代謝方程分別為

SMZ在鯉血漿、肌肉、肝胰臟和腎中的藥時關(guān)系均符合一級吸收二室開放模型，其方程分別為

各采樣時間點，不同組織中TMP及SMZ含量的變化如圖1所示。

TMP和SMZ在松浦鏡鯉體內(nèi)主要藥代動力學(xué)參數(shù)如表2所示。

表1 TMP和SMZ在不同組織中的平均回收率Tab.1 Recovery of trimethoprim(TMP)and sulfamethoxazole(SMZ)in different tissues %

2.4 殘留消除規(guī)律

各采樣時間點，TMP和SMZ在不同組織中的質(zhì)量濃度見表3。由表3可以看出，在停止給藥24 h后，SMZ在松浦鏡鯉體內(nèi)的殘留量仍然維持在較高的水平，并且高于TMP在相應(yīng)各組織中的殘留量。隨著停藥時間的延長，SMZ在松浦鏡鯉體內(nèi)的消除要快于TMP，并于停藥后第8天開始在各組織中的殘留量低于TMP，于第9天開始低于0．10 mg/kg。而TMP在肌肉和皮中的殘留量降到0．06 mg/kg后，消除開始極其緩慢。最終，TMP在各組織中的殘留量于停藥后第15天開始低于0．05 mg/kg。

圖1 松浦鏡鯉4種組織中TMP和SMZ濃度與時間的關(guān)系曲線Fig.1 Concentration-time curve of TMP and SMZ in four tissues of Songpu mirror carp Cyprinus carpio Songpu

表2 TMP和SMZ在松浦鏡鯉體內(nèi)主要藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of TMP and SMZ in Songpu mirror carp Cyprinus carpio Songpu after oral administration

表3 TMP和SMZ在松浦鏡鯉3種組織中的殘留濃度Tab.3 Residual concentrations of TMP and SMZ in three tissues of Songpu mirror carp Cyprinus carpio Songpu mg/kg or mg/L

3 討論

3.1 復(fù)方磺胺甲噁唑在松浦鏡鯉體內(nèi)的藥動學(xué)特征

本試驗中，TMP在血漿、肌肉中的藥物濃度與時間的關(guān)系符合一級吸收一室開放模型，這與艾曉輝等［6］報道TMP在草魚血漿中的藥動學(xué)模型為二室模型不同。SMZ在血漿、肌肉、肝胰臟、腎中的藥物濃度與時間的關(guān)系均符合一級吸收二室開放模型，這與王群等［11］報道的SMZ在鱸血液中、曲志娜等［5］報道的SMZ在大菱鲆肌肉中、袁科平等［12］報道的SMZ在羅非魚血漿和肌肉中的藥動模型為一室模型不同，而與艾曉輝等［6］報道的SMZ在草魚血漿和肌肉中、曲志娜等［5］報道的SMZ在大菱鲆血液中、范克儉［13］報道的SMZ在中國明對蝦血液中的藥動模型為二室模型相同。這些模型的差異，一方面與試驗對象的種屬差異有關(guān)，另一方面也可能與試驗條件有關(guān)，包括給藥劑量、水溫、采樣時間等。

由本試驗結(jié)果可以看出，給藥后0．25 h時，鯉肝胰臟中TMP和SMZ的含量均明顯超過其他組織，說明兩種藥物進入松浦鏡鯉體內(nèi)后，具有明顯的“首過效應(yīng)”。而初始幾個采樣時間點SMZ在血漿中的含量也明顯高于肌肉和腎臟組織中，且0．25 h時組織中的藥物含量略高于0．5 h和0．75 h，據(jù)此推測，SMZ從腸道被吸收進入肝胰臟后，有一部分藥物直接經(jīng)肝胰臟進入血液循環(huán)，因此，血漿中的藥物來源出現(xiàn)了腸道吸收和肝胰臟釋放的疊加，從而造成血漿中SMZ含量明顯偏高的情況。從藥-時曲線可以看出，SMZ出現(xiàn)了明顯的雙峰現(xiàn)象。出現(xiàn)雙峰乃至多峰現(xiàn)象的機制被認為可能是腸-肝循環(huán)和胃腸道的多部位吸收［14］，而腸-肝循環(huán)又被認為是產(chǎn)生雙峰或者多峰現(xiàn)象最有可能的一種機制，如果存在腸-肝循環(huán)，則第二峰的濃度要低于第一峰［15-16］。本試驗中，松浦鏡鯉4種組織中SMZ在給藥后24 h出現(xiàn)的第二峰值均小于第一峰值，這一現(xiàn)象與腸-肝循環(huán)引起的藥-時曲線雙峰的情況完全相符。

Tmax、T1/2ka、ka是反映藥物吸收速率的重要指標(biāo)，β和T1/2β則是反映藥物消除速率的重要指標(biāo)。本試驗中，松浦鏡鯉口服復(fù)方磺胺甲噁唑后，對比TMP在4種組織中的ka、T1/2ka、Tmax值，發(fā)現(xiàn)TMP在肌肉中的吸收速率明顯低于其他3種組織，并且達峰濃度Cmax也明顯低于肝胰臟、腎組織;同時，TMP在肌肉中的β值大于肝胰臟、腎組織，T1/2β值明顯小于肝胰臟和腎，由此發(fā)現(xiàn)，TMP在肌肉中的消除速率也較肝胰臟、腎迅速。同樣，通過對比以上各參數(shù)，發(fā)現(xiàn)SMZ在松浦鏡鯉肌肉中，相對于肝胰臟和腎表現(xiàn)為吸收慢、消除慢的特征。艾曉輝等［17］對SMZ在草魚體內(nèi)的研究以及曲志娜等［5］對SMZ在大菱鲆體內(nèi)的研究都發(fā)現(xiàn)，SMZ在肌肉中的藥動學(xué)行為有類似的特點。

3.2 復(fù)方磺胺甲噁唑在松浦鏡鯉體內(nèi)的殘留消除規(guī)律

對于動物源性食品中藥物殘留的檢測，一般只選取可食性組織，中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準NY 5070—2002《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中提到的魚類中藥物殘留的檢測對象為肌肉和皮?？紤]到肌肉中有血管的分布，因此，本研究中選取血漿、皮、肌肉作為檢測對象，進行復(fù)方磺胺甲噁唑在松浦鏡鯉體內(nèi)的殘留消除規(guī)律研究。

在 (20±0．5)℃水溫條件下，以有效成分50 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量，每天一次，連續(xù)5 d對松浦鏡鯉口灌復(fù)方磺胺甲噁唑粉混懸液后，TMP和SMZ在停藥的前3 d均出現(xiàn)了明顯的下降趨勢。在停藥后的第一天，SMZ在血漿、皮和肌肉中的殘留量均遠大于TMP，但在停藥后第7天在肌肉中以及停藥后第8天在血漿和皮中，SMZ殘留量開始低于TMP。說明TMP在松浦鏡鯉體內(nèi)較SMZ消除緩慢，尤其是到停藥第7天后，TMP在肌肉和皮中消除速度極其緩慢，由此發(fā)現(xiàn)，復(fù)方磺胺甲噁唑休藥期制定的主要影響因素應(yīng)該是TMP的消除速度。

3.3 復(fù)方磺胺甲噁唑的效果評價與休藥期

根據(jù)《新編漁藥手冊》記載，磺胺類藥物對敏感菌的最小抑菌濃度 (MIC)多為0．1～0．5 mg/L［18］，而報道的SMZ對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見致病菌的MIC 為0．4 ～1．6 mg/L［19］?？紤]到 SMZ 在與 TMP聯(lián)合使用的情況下抗菌作用更強［20］，抗菌效果可增加數(shù)倍，因此，復(fù)方磺胺甲噁唑?qū)χ虏【腗IC值理應(yīng)較SMZ低。但是，目前對于復(fù)方磺胺甲噁唑?qū)λa(chǎn)常見致病菌的MIC研究極其缺乏，僅見宋學(xué)宏等［21］報道了復(fù)方新諾明對1996年蘇州地區(qū)育苗場羅氏沼蝦暴發(fā)性疾病病原菌的MIC為0．5 mg/L。如果以0．5 mg/L作為參考值，復(fù)方磺胺甲噁唑以50 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量一次給藥后，其在松浦鏡鯉體內(nèi)血漿、肌肉、肝胰臟和腎中72 h內(nèi)的濃度均能起到殺菌和抑菌效果。而以50 mg/kg(體質(zhì)量)劑量每天一次連續(xù)5 d給藥后，其在松浦鏡鯉血漿、肌肉和皮中的濃度在停藥后6 d內(nèi)可以起到殺菌和抑菌效果。

在 (20±0．5)℃水溫條件下，松浦鏡鯉按有效成分50 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量，每天一次，連續(xù)5 d口灌復(fù)方磺胺甲噁唑后，由檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，各組織中SMZ和TMP的含量分別于停藥后第9天和第15天開始低于中國規(guī)定的磺胺類與增效劑最高殘留限量 (磺胺類為100 μg/kg，TMP為50 μg/kg)。因此，單獨對松浦鏡鯉使用復(fù)方磺胺甲噁唑時，按50 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量，每天1次，連續(xù)5 d口灌復(fù)方磺胺甲噁唑后，其休藥期(WDT)可定為15 d。

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