王瓊, 唐俊妮, 湯承, 陳娟, 劉驥

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

針對不同來源金黃色葡萄球菌分離菌株的agr I-IV分型初探

王瓊, 唐俊妮, 湯承, 陳娟, 劉驥

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

目的:金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子(agr)位點(diǎn)是一個(gè)全面的群集感應(yīng)系統(tǒng)并且控制著毒力因子的產(chǎn)生, 本研究旨在針對不同來源的金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行agr I-IV基因分型研究.方法:根據(jù)金黃色葡萄球菌agrI-IV基因組別類型的引物, 對五種不同來源的169株金黃色葡萄球菌DNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增, 獲得目的基因,以判斷agr基因型.結(jié)果:169株分離菌株中,agrⅡ型的檢出率為19%(32/169),agrⅢ型檢出率為12%(20/169),agrⅣ型檢出率為8%(14/169), 五種不同來源的金黃色葡萄球菌均有檢出agrⅡ型, 均未檢出agrⅠ型, 并且都含有未能分型的agr陰性菌株. 研究結(jié)果表明不同來源金黃色葡萄球菌分離菌株中agrI-IV基因型的流行情況. 該方法對于金黃色葡萄球菌菌株分子分型有一定的借鑒意義, 也為金黃色葡萄球菌菌株分子流行病學(xué)調(diào)查奠定一定的基礎(chǔ).

金黃色葡萄球菌; 分離菌株; agr基因

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌, 可引起人和動物的多種疾病. 金黃色葡萄球菌能夠分泌多種毒素和酶, 這些毒力蛋白的表達(dá)是由RNA III調(diào)控, 它是agr(accessory gene regulator)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的一個(gè)中心多向調(diào)節(jié)子, RNA III 目前認(rèn)為至少是由兩個(gè)雙組份系統(tǒng)激活, 這兩個(gè)雙組份系統(tǒng)一個(gè)是由agr位點(diǎn)編碼的AgrC與AgrA, 在金黃色葡萄菌中, 了解最清楚的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)是AgrCA[1]; 另一個(gè)是RNA III激活蛋白靶點(diǎn)(TRAP)及RNA III激活蛋白(RAP).agr系統(tǒng)是一個(gè)群集感應(yīng)系統(tǒng), 在細(xì)菌從對數(shù)生長期到穩(wěn)定期的過程中,它可以下調(diào)金黃色葡萄球菌的一些編碼表面蛋白的基因轉(zhuǎn)錄, 同時(shí)可以上調(diào)一些胞外毒素的轉(zhuǎn)錄[2].agr位點(diǎn)包含兩個(gè)反向的轉(zhuǎn)錄單元RNAII和RNAIII, 分別由P2和P3啟動子控制, RNAII是多順反子的轉(zhuǎn)錄單元, 包括AgrA、AgrB、AgrC、AgrD共4個(gè)開放閱讀框(ORF), P2 操縱元編碼一個(gè)雙組份的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(AgrC, 轉(zhuǎn)膜受體組氨酸激酶; AgrA, 細(xì)胞質(zhì)調(diào)控子), 一個(gè)前肽(AgrD), 和一個(gè)完整膜蛋白(AgrB)[3]. 在細(xì)菌生長的過程中, 成熟的自動誘導(dǎo)肽(AIP)累積在胞外環(huán)境中到達(dá)一個(gè)閾值濃度時(shí), 就會通過磷酸化作用激活雙組份系統(tǒng)AgrCA. 磷酸化的AgrA受到感應(yīng)后, 上調(diào)啟動子P2的轉(zhuǎn)錄, 經(jīng)過擴(kuò)大反應(yīng), 起始啟動子P3的轉(zhuǎn)錄, P3轉(zhuǎn)錄體RNA III, 協(xié)調(diào)毒力因子分泌的上調(diào), 同時(shí)下調(diào)表面蛋白[4]. Ji等[5]描述了特定的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的AIP能夠激活它自己的agr位點(diǎn),但可能會抑制其它菌株的agr表達(dá). 這種現(xiàn)象的觀察使得進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不同菌株agr位點(diǎn)可變區(qū)呈現(xiàn)多態(tài)性, 這個(gè)可變區(qū)包含編碼AgrD的核酸序列, AgrB的C末端的2/3序列, 以及AgrC的N末端的部分序列, 導(dǎo)致4個(gè)不同部分的相互干涉, 利用這一點(diǎn)可進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離菌株的分型研究[4]. 另外, RAP-TRAP是第二個(gè)雙組份單元系統(tǒng), 也顯示能夠激活RNA III的轉(zhuǎn)錄. 在細(xì)菌生長的初始階段, RNA III激活蛋白RAP累積并誘導(dǎo)RNA III激活蛋白靶點(diǎn)TRAP的磷酸化, 結(jié)果上調(diào)agr位點(diǎn)產(chǎn)生RNA II, 前面也提及RNAII是多順反子的轉(zhuǎn)錄單元, 一旦agr位點(diǎn)在生長的對數(shù)中期被激活, AIP和AgrC產(chǎn)生, AIP累積在環(huán)境中, 誘導(dǎo)AgrC的磷酸化, 導(dǎo)致AgrA的磷酸化, 上調(diào)RNA III合成, 下調(diào)TRAP磷酸化[6]. 可以看出, 金黃色葡萄球菌的大多數(shù)毒力因子是由agr位點(diǎn)調(diào)控, 基于agr編

碼的自動誘導(dǎo)肽和相關(guān)受體的氨基酸序列多態(tài)性, 學(xué)者們把金黃色葡萄球菌agr分成4個(gè)主要組別(I-IV)[7]. 因此,本研究我們利用多重PCR技術(shù), 初步探索agr I-IV基因型在不同來源的金黃色葡萄球菌臨床分離菌株的分子流行狀況, 為金黃色葡萄球菌菌株流行特征調(diào)查和菌株分型奠定一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

人源金黃色葡萄球菌分離菌株8株; 牦牛源金黃色葡萄球菌分離菌株13株; 食品源金黃色葡萄球菌分離菌株104株; 雞源金黃色葡萄球菌分離菌株28株; 羊源金黃色葡萄球菌分離菌株16株(由本實(shí)驗(yàn)室已鑒定和保存).

1.1.2 試劑

酵母提取物, 胰化蛋白胨, 購自O(shè)XOID英國; 瓊脂糖(Agarose G-10)購自Biowest 香港; PCR擴(kuò)增試劑(Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、10×PCR buffer)、100～2000 bp DNA Ladder Marker、RNase(1 mg/ml)、溶菌酶(20 mg/ml)、蛋白酶K(10 mg/ml)、6×上樣buffer: 大連寶生物工程有限公司; 瓊脂粉、NaCl、無水乙醇、EDTA、SDS、苯酚、氯仿、異戊醇、醋酸鈉, 購自成都市科龍化工試劑廠

1.1.3 儀器

Centrifuge 5417R冷凍離心機(jī), Eppendorf; YN100P制冰機(jī), 因紐特; DYY-6C型電泳儀, 北京六一儀器廠; TSNENEN031445PCR儀, BIO-RAD美國; MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋, SANYO日本; SW-CJ-1F超凈工作臺, 蘇凈集團(tuán)安泰公司; XW-80A渦旋儀(Vortex): 上海青浦瀘西儀器廠; Gel Doc XR S.N76S/03894凝膠成像儀, BIO-RAD 美國; SmartSpecTM plus, BIO-RAD 美國; HH數(shù)顯恒溫水浴鍋, 金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司; DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱, 上海一恒科技有限公司; GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱, 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司; HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱, 中國哈爾等濱：川市西東獐聯(lián)牙電菜子多技

糖的術(shù)提開取發(fā)及有含限量公測定司; AKHL-Ⅲ-24型艾科(臺灣)超純水系統(tǒng), 成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)方法

所有金黃色葡萄球菌株均分別在平板上劃線分離, 挑取單菌落, 接種于5毫升LB液體培養(yǎng)基中, 37℃搖振(180 r/m)過夜培養(yǎng)(16小時(shí)), 用于DNA的制備.

1.2.2 模板DNA的提取

金黃色葡萄球菌分離菌株的DNA提取采用文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行.

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)agr等位基因 (I-IV)四種類型, 引物合成參考文獻(xiàn)[7]. 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小詳見表1.

表1 引物序列及目的產(chǎn)物大小Table 1 The primer sequence used in this study and the product size

1.2.4 多重PCR擴(kuò)增條件

多重PCR擴(kuò)增體系詳見表2, PCR擴(kuò)增條件如下: 95℃ 5min; 95℃ 40s、58℃ 50s、72℃ 50s進(jìn)行35 個(gè)循環(huán); 72℃ 延伸 10min, 4℃保存. 擴(kuò)增完畢取擴(kuò)增后的產(chǎn)物8μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電脈(1.5%), 80V, 40min, 凝膠成像系統(tǒng)照相, 觀察擴(kuò)增條帶, 比較電泳圖象.

表2 多重PCR擴(kuò)增體系(20μL)Table 2 The multiple PCR system used in this study

2 結(jié)果與分析

利用四對引物分別對169株不同來源的金黃色葡萄球菌分離菌株提取的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增, 根據(jù)多重PCR檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3, 其中66株分離菌株能夠采用agrI-IV基因進(jìn)行分型, 103株菌株不能采用該方法進(jìn)行分型, 總agr基因檢出率為39%(66/169); 其中, 人源金黃色葡萄球菌有6株菌株為agrⅡ型, 1株菌株為agrⅣ型, 1株菌株未能分型. 牦牛源金黃色葡萄球菌有6株菌株為agrⅡ型, 2株菌株為agrⅣ型, 5株菌株未能分型. 食品源金黃色葡萄球菌有1株為agrⅡ型, 20株菌株為agrⅢ型, 11株菌株為agrⅣ型, 72株菌株未能分型. 雞源金黃色葡萄球菌有5株菌株為agrⅡ型, 23株菌株未能分型. 羊源金黃色葡萄球菌有14株菌株為agrⅡ型, 2株菌株未能分型. 五種不同來源的金黃色葡萄球菌分離菌株中均有檢出agrⅡ型, 均未檢出有agrⅠ型,agrⅡ型的檢出率為19%(32/169),agrⅢ型檢出率為12%(20/169),agrⅣ型檢出率為8%(14/169). 由表4可以看出不同來源的分離菌株的檢測率具有很大的差異性. 人源和羊源分離菌株采用agr基因分型率較高可達(dá)到87.5%,牦牛源次之達(dá)到61.5%, 而食品源和雞源分離菌株的分型率相對較低, 分別各占30.8%和17.9%.

表3 不同來源金黃色葡萄球菌分離菌株agr基因型統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 The detection results of agr I-IV in S. aureus isolates from different sources

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表4 不同來源的分離菌株agr基因分型檢出率Table 4 The detection ratio of agr I-IV in S. aureus isolates from different sources

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種重要的機(jī)會致病菌, 能夠引起人和動物的多種疾病, 如心內(nèi)膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎和奶牛乳房炎等, 它也是社區(qū)和醫(yī)院感染疾病中發(fā)病率和死亡率最高的病原菌[9]. 金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)agr是最早發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌調(diào)控位點(diǎn)[10], 同時(shí)也被認(rèn)為是金黃色葡萄球菌最重要的群集感應(yīng)系統(tǒng),它影響著許多外毒素和胞外蛋白的分泌表達(dá). 本研究利用agr基因位點(diǎn)序列的多態(tài)性對不同來源的金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行agrI- IV分型研究初探, 結(jié)果表明不同來源的金黃色葡萄球菌分離菌株中agrII型流行性最高,緊接著是agrIII, 從我們的研究結(jié)果可以看出, 五種不同來源的所有分離菌株中都有agrII型出現(xiàn). 我們的研究結(jié)果與其它研究具有一定的差異性[11], Khan等[11]在調(diào)查醫(yī)院源的金黃色葡萄球菌分離菌株時(shí), 發(fā)現(xiàn)agr I的流行

性最高, 緊接著是agr III. 同樣Xie等[7]的研究也表明108株醫(yī)院源菌株分離菌株中, agr I 型占據(jù)最流行地位,所有的108株菌株中65株是agr I, 其次是agr III、agr II和agr IV. 我們的研究也發(fā)現(xiàn)agr III的流行占據(jù)次之位臵, 這一點(diǎn)與其它的研究具有一致性. Khan等[11]和Xie等[7]的研究都是針對醫(yī)院源的分離菌株, 而我們的研究擴(kuò)大了范圍, 本文針對人源, 牦牛源, 食品源, 雞源和羊源金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行agrI-IV基因型的初探,結(jié)果同樣具有一定的借鑒意義, 從我們的研究結(jié)果可以看出不同來源的菌株之間存在一定的差異性. 另外, 我們的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn), 存在大量的菌株不能采用I- IV基因型方法進(jìn)行分類, 這一點(diǎn)在其它文獻(xiàn)研究中也提及到[7,11],未能分型的菌株說明agr陰性的金黃色葡萄球菌菌株大量存在, 盡管agr基因在細(xì)菌的毒力調(diào)節(jié)上具有重要的影響. Paulander等[12]的研究指出15-60%的金黃色葡萄球菌臨床分離菌株是agr缺陷性菌株, 他們的研究認(rèn)為抗生素的過量使用是造成金黃色葡萄球菌大量菌株出現(xiàn)agr陰性的原因, agr的缺失與抗生素的使用和菌株的變異之間存在著直接的聯(lián)系, 并且認(rèn)為agr陰性的菌株比agr陽性的菌株對某些抗生素的亞致死濃度具有更好的適應(yīng)性,這或許能夠解釋我們的樣品中含有大量未分型金黃色葡萄球菌的原因, 也暗示了抗生素在我國養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用. 我們未來的研究看能否關(guān)聯(lián)agr陰性菌株與細(xì)菌的耐藥之間的聯(lián)系. 本文研究為金黃色葡萄球菌分離菌株的分子分型奠定一定基礎(chǔ), 同時(shí)也為進(jìn)一步探討金黃色葡萄球菌毒力因子奠定基礎(chǔ).

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Investigation of the agr I-IV groups in Staphylococcus aureus isolates from five different sources

WANG Qiong, TANG jun-ni, TANG Cheng, CHEN Juan, LIU Ji
(Schoolof Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:The accessory gene regulator (agr) locus inStaphylococcus aureusis a global regulator of quorum sensing and controls the production of many virulence factors. This study was carried out to investigate the agr I-IV groups in Staphylococcus aureus isolates from five different sources.Methods:According to agr allele types (I – IV) specific primers, multiplex PCR was used to amplify the extracted DNA of 169 S.aureusisolates and to determine the agr groups.Results:The agr groups’ distribution in 169 S. aureus isolates was as follows: 19%(32/169) belonged toagrⅡ, 12%(20/169) belonged to agr Ⅲ and 8%(14/169) belonged toagrⅣ. agr I was not detected in all the isolates. For 109 isolates, the agr group was not detected. This study shows that different agr I-IV groups prevail over our area and agr typing has some significance to investigate the genotypic information of the S. aureus isolated strains.

Staphylococcus aureus; isolates; agr I-IV

R117

: A

: 1003-4271(2014)03-0354-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.06

2014-04-01

唐俊妮(1971-), 女, 漢族, 湖北棗陽人, 副研究員, 研究方向: 食品質(zhì)量與安全, E-mail: junneytang@aliyun.com.