吳晗，白俊杰，姜鵬

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州510380;2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023)

唐魚Tanichthys albonubes 隸屬于鯉形目、鯉科、魚丹亞科、唐魚屬，最早被發(fā)現(xiàn)于廣州市白云山附近的溪流中，是一種小型的淡水觀賞魚類。珠江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室于2003年利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功篩選獲得了一個可穩(wěn)定遺傳、體色紅艷的轉(zhuǎn)基因唐魚新品系［1］。轉(zhuǎn)基因唐魚能否進(jìn)入市場，實現(xiàn)商品化，需要評估其安全性，并獲得轉(zhuǎn)基因生物安全管理部門的批準(zhǔn)。有研究表明，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生唐魚的生物學(xué)、抗逆性和生存競爭能力等無顯著性差異［2-6］。

pH是影響魚類生存的重要環(huán)境因子之一，pH過低或過高均能降低魚類對低氧的耐受力［7］，直接影響魚類的生長發(fā)育和生理狀況［8］。本研究中，比較了不同pH 條件下最為敏感的唐魚早期發(fā)育階段，轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白基因唐魚與野生型唐魚的孵化率、初孵仔魚活力和仔魚耐受力，旨在了解轉(zhuǎn)基因唐魚是否存在生存優(yōu)勢，以及在自然水域是否對野生型唐魚形成危脅。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚取自珠江水產(chǎn)研究所觀賞魚養(yǎng)殖基地。取性腺發(fā)育良好、體質(zhì)健壯、無傷病的轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚雌、雄親本，分別置于4 個不同的水族箱中，暫養(yǎng)2 周后同時配對繁殖，產(chǎn)出的活體胚胎即為試驗材料。試驗用水為充分曝氣的自來水，試驗前配制0.1 mol/L NaHCO3和HCl 溶液。

1.2 方法

1.2.1 不同pH 條件下受精卵的孵化 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，在pH 為6.0 ～8.0 時轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚受精卵的孵化率相似，配制pH 分別為3.0 ～5.5，8.5 ～10.5 的試驗用水，以曝氣自來水(pH 7.0)為對照組。在顯微鏡下篩選已受精的轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚活體胚胎，分別放入盛有500 mL 不同pH 試驗水的燒杯中，每個燒杯中放30 粒受精卵，每組設(shè)3 個平行。在恒溫(25 ℃±0.5 ℃)下靜水孵化，孵化期間每隔4 h 更換1/2試驗水，并統(tǒng)計出膜的仔魚數(shù)。

1.2.2 不同pH 條件下仔魚的急性毒性試驗 pH梯度設(shè)置同“1.2.1”節(jié)，仔魚孵化出10 d 后，從同批卵的孵化槽中選取轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚仔魚各10 尾，放入盛有不同pH 試驗水的1000 mL燒杯中，在恒溫(25 ℃±0.5 ℃)下靜水培育，每組設(shè)3 個平行。試驗期間不投餌，每4 h 更換一次試驗水，維持穩(wěn)定的pH。試驗持續(xù)4 d。

1.2.3 pH 急性毒性試驗中仔魚的存活系數(shù) 從同批卵的孵化槽中選取剛出膜的轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚仔魚各50 尾，放入盛有1000 mL 試驗水、pH為4.5 ～9.0 的燒杯中。將燒杯置于恒溫(25 ℃±0.5 ℃)培養(yǎng)箱中靜水培育，每隔4 h 更換一次試驗水。每天記錄、撈出死亡的仔魚數(shù)，直至仔魚全部死亡，計算不投餌存活系數(shù)(survival activity index，SAI)，其計算公式［9］為

其中:N 為試驗初始的仔魚數(shù);k 為仔魚全部死亡所需的天數(shù);hi為第i天時仔魚的累積死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示，用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。急性毒性的LC50及其95%置信區(qū)間通過Probit 過程來估算，依據(jù)95%置信區(qū)間有無重疊來判定兩組之間的LC50差異顯著性［10］。

2 結(jié)果

2.1 不同pH 下唐魚受精卵的孵化率

從表1可見:當(dāng)pH 低于3 或高于10.5 時，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚的受精卵不能孵化;在酸性條件下，兩種唐魚的孵化率隨pH 的升高而升高;在堿性條件下，孵化率均隨pH 的升高而降低。在相同pH 條件下，野生型唐魚的孵化率高于轉(zhuǎn)基因唐魚(pH 為9.0 時除外)，但經(jīng)卡方檢驗，二者無顯著性差異(P＞0.05)。持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，pH 低于4.5和高于9.0 時仔魚畸形，48 h 后無存活個體。

表1 不同pH 條件下轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚受精卵的孵化率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.1 The hatching rates(mean±S.E.)of the fertilized eggs in the transgenic and wild－type white cloud mountain minnow Tanichthys albonubes under different pH values %

2.2 不同pH 下仔魚的急性毒性

從表2可見:當(dāng)pH 為5.0 ～9.0 時，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚仔魚96 h 內(nèi)的死亡率均不高于10%;當(dāng)pH 低于4.0 或高于10.0 時，兩種仔魚96 h 的死亡率均達(dá)到100%。

表2 不同pH 條件下轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚的平均死亡率Tab.2 The average mortality of transgenic and wild－type white cloud mountain minnow Tanichthys albonubes under different pH values %

從表3可見:在酸性環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因唐魚仔魚的半致死pH 略高于野生型唐魚;在堿性環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因唐魚仔魚的半致死pH 略低于野生型唐魚;在相同pH 條件下，95%置信區(qū)間均重疊，兩組間的LC50則無顯著性差異。

表3 不同pH 條件下轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚的LC50Tab.3 The LC50 of transgenic and wild－type white cloud mountain minnow Tanichthys albonubes under different pH values

2.3 不同pH 下唐魚仔魚的不投餌存活系數(shù)

從圖1可見，在pH 為4.5 ～8.5 的條件下，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚仔魚的SAI 均增長，并在pH 為8.5 時達(dá)最大值，pH 升至9.0 時，SAI 下降;在相同的pH 條件下，野生型唐魚仔魚的SAI 高于轉(zhuǎn)基因唐魚仔魚(pH 為4.5 時除外)。

圖1 不同pH 條件下唐魚仔魚的不投餌存活系數(shù)Fig.1 Survival activity index(SAI)of the transgenic and wide－type white cloud mountain minnow Tanichthys albonubes under different pH values

3 討論

pH 直接影響與魚類孵化相關(guān)的各種蛋白水解酶的活力，使魚類孵化具有很強(qiáng)的pH 依賴性［11］。魚類胚胎在pH 過低或過高的水體中都不能孵化，即使出膜，仔魚也呈向背腹方向彎曲的畸形狀［12］。四大家魚胚胎存活的pH 下限為6.0［13］，本試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚受精卵孵化的適宜pH 為5.0 ～8.5，說明唐魚對酸性水體的敏感性不如四大家魚，具有較強(qiáng)的酸適應(yīng)能力。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，唐魚棲息在pH 為4.34 的環(huán)境中仍能正常生存［14］。本試驗中，唐魚受精卵的孵化對酸性水體并不敏感，可能與其長期生活的水體環(huán)境有關(guān)。一些淡水魚類如青魚Mylopharyngodon piceu、草魚Ctenopharyngodon idellus、鰱 Hypophthamichthys molitrix、鳙Aristchthys nobilis等對pH 的適宜范圍為4.6 ～10.2，鯉Cyprinus carpio 為4.4 ～10.4［15］。本試驗中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚仔魚適宜生存的pH 為5.0 ～9.0，二者對pH 變化的耐受性均較低，這可能與仔魚對環(huán)境中不利因子的抵抗力較成魚差有關(guān)。經(jīng)檢驗，在相同pH 條件下，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚的孵化率及初孵仔魚的存活率均無顯著性差異，表明當(dāng)水中pH 變動較大時，轉(zhuǎn)基因唐魚并沒有生存優(yōu)勢。

不投餌存活系數(shù)(SAI)可用來判斷仔魚活力和受精卵的質(zhì)量［16］，

SAI 值越大，受精卵的質(zhì)量和仔魚的活力就越好［17］。初孵唐魚仔魚的營養(yǎng)模式為卵黃營養(yǎng)，卵黃吸收完后依靠攝食餌料生活［18］，而唐魚對開口餌料的選擇較為狹窄，當(dāng)水體中無適宜的開口餌料時，卵黃營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量將直接影響唐魚仔魚的存活。本試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚的SAI在最適pH 條件下分別為54.1和61.7，高于泥鰍Misgurunus anguillicaudatus(27.0)［16］、斜帶石斑魚Epinephelus coioides(約25)［19］，而與黃鰭東方鲀Fugu xanthopterus(61.7)相近［20］，說明唐魚具有較強(qiáng)的耐饑餓能力，這與陳國柱等［21］、樊佳佳等［22］的研究結(jié)果一致。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，唐魚繁殖期較長，繁殖期餌料生物變動較大，仔魚期可能遭受饑餓脅迫。本研究中發(fā)現(xiàn)，在不同pH 條件下，野生型唐魚仔魚的SAI 略高于轉(zhuǎn)基因唐魚，由此推測，當(dāng)轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚初孵仔魚同處于缺乏適宜開口餌料的環(huán)境中時，轉(zhuǎn)基因唐魚仔魚死亡更早，原因可能是轉(zhuǎn)基因唐魚仔魚的表達(dá)消耗了卵黃中一部分營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致其正常生理代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)減少。

綜上所述，在不同pH 條件下，轉(zhuǎn)基因唐魚的孵化率、仔魚耐受性和仔魚耐饑餓能力均低于野生型唐魚。因此，若轉(zhuǎn)基因唐魚進(jìn)入自然水域中，也不會威脅野生唐魚的生存。

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