竇妍，丁君，王軼南，穆曉虎

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

20世紀(jì)80年代以來，刺參Apostichopus japonicus 的增養(yǎng)殖在中國北方沿海蓬勃開展，然而隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，刺參病害問題日益突出，成為制約該養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的瓶頸［1］。微生物在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮重要作用，養(yǎng)殖生物與其有著密切的關(guān)系，常常是引起養(yǎng)殖對(duì)象致病的病原或條件致病性病原。研究表明，細(xì)菌性疾病在刺參養(yǎng)殖中非常普遍［2］，因此，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中微生物多樣性的研究具有重要意義。

自然界中絕大部分細(xì)菌不可培養(yǎng)，傳統(tǒng)純培養(yǎng)法只能培養(yǎng)出較少細(xì)菌種類，不能真實(shí)反映菌群結(jié)構(gòu)［3］?，F(xiàn)代分子生物學(xué)方法為微生物多樣性的研究提供了有效手段，16S rDNA 法不依賴于培養(yǎng)出的菌株，而是以樣品中細(xì)菌的DNA 為研究目標(biāo)進(jìn)行克隆分析，從而能更真實(shí)地反映所檢測(cè)樣品的菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性。國內(nèi)外已有學(xué)者利用16S rDNA 克隆文庫法對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，李革雷等［4］研究了3種養(yǎng)殖模式水體中的細(xì)菌多樣性，Sekigucui等［5］研究了鄱陽湖湖口水體的菌群結(jié)構(gòu)，Julian等［6］分析了深海沉積物的菌群多樣性，鄭艷玲等［7］研究了崇明東灘夏冬兩季沉積物中的菌群結(jié)構(gòu)，丁君等［8］檢測(cè)了刺參消化道的細(xì)菌種類。本研究中，以中國北方黃海和渤海刺參養(yǎng)殖區(qū)的海水、沉積物和刺參腸道內(nèi)容物中細(xì)菌基因組為模板，構(gòu)建16S rDNA 克隆文庫，分析北方養(yǎng)殖刺參內(nèi)外生境菌群的多樣性以及黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘和刺參腸道中的菌群結(jié)構(gòu)，旨在為構(gòu)建中國北方刺參養(yǎng)殖池塘菌庫提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參樣品于2012年5月分別采集于黃海、渤海養(yǎng)殖區(qū)某刺參養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 樣品的采集參照王軼南等［9］的方法。黃海刺參腸道內(nèi)容物、池塘沉積物、海水樣品分別標(biāo)記為YSp1、YSp2、YSp3;渤海刺參腸道內(nèi)容物、池塘沉積物、海水樣品分別標(biāo)記為BSp1、BSp2、BSp3。

1.2.2 樣品DNA 的提取 刺參腸道內(nèi)容物、池塘沉積物和海水樣品中細(xì)菌DNA 的提取參照王軼南等［9］的方法。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增16S rDNA 采用16S rDNA 通用PCR 引物27F(5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')和1492R(5' GGTTACCTTGTTACGACTT 3')對(duì)樣品DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(共25 μL):2 ×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃下預(yù)變性2 min;94 ℃下變性30 s，52 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸5 min，4 ℃下保存?zhèn)溆?。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳確定目的條帶后，切膠回收純化。

1.2.4 16S rDNA 克隆文庫的構(gòu)建 經(jīng)純化后的PCR 產(chǎn)物連接到載體pMD19 -T 中，16 ℃下連接30 min;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，在不含氨芐青霉素(Amp)的液體LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h后，涂布于含有X -gal、IPTG和Amp 的LB 培養(yǎng)基上;隨機(jī)挑選100 個(gè)左右白色克隆子送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 文庫分析 用VecScreen 程序去除載體序列，用DECIPHER在線軟件［10］進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)。用Mothu 軟件［11］對(duì)所得有效序列進(jìn)行分析，以97%相似性為標(biāo)準(zhǔn)劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。用RDP - Classifier在線軟件［12］(http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)對(duì)所得有效序列進(jìn)行菌屬鑒定?；贠TU，用SPADE 軟件［13］計(jì)算YSp1、YSp2、YSp3、BSp1、BSp2、BSp3 克隆文庫的覆蓋率、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)。將每個(gè)OTU 中的代表序列利用GenBank 數(shù)據(jù)庫中Blast 程序進(jìn)行相似性比對(duì)，并挑選相近序列。采用Neighbor - joining 法［14］并將自展值設(shè)為1000次［15］，應(yīng)用Mega 5.22 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA 擴(kuò)增檢測(cè)

樣品DNA PCR 擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，擴(kuò)增條帶單一，擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期結(jié)果(約1500 bp)，表明擴(kuò)增效果較好。

圖1 PCR 擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gelectrophoresis of bacterial 16S rDNA PCR production

2.2 多樣性分析

6 個(gè)克隆文庫中的克隆序列經(jīng)載體去除和嵌合體檢測(cè)后，共得到540 條有效克隆序列，所有序列可歸為37 個(gè)OTUs。6 個(gè)文庫的覆蓋率為86.5% ～99.0%。其中黃海春季刺參養(yǎng)殖池塘海水(YSp3)文庫的香農(nóng)指數(shù)最大(2.986)，辛普森指數(shù)最小(0.099 10)，群落多樣性較高(表1)。

表1 黃、渤海春季刺參腸道及養(yǎng)殖池塘的細(xì)菌多樣性Tab.1 Flora diversity of bacterial communities from the intestine and culture ponds of sea cucumber Apostichopus japonicus from Yellow Sea and Bohai in spring

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

黃、渤海春季養(yǎng)殖刺參內(nèi)外生境中，6 個(gè)文庫序列可歸為5 個(gè)門類(圖2):變形菌Proteobacteria、藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes和厚壁菌門Firmicutes，其中變形菌均為6 個(gè)文庫的優(yōu)勢(shì)門類(變形菌比28 例＞41%);在文庫所含變形菌的4 個(gè)亞門(Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria)中，除YSp3 文庫中α-變形菌占優(yōu)勢(shì)外，其余文庫中均以γ -變形菌占優(yōu)勢(shì)?；赗DP -Classifier在線軟件分析，γ-變形菌中能夠分到屬水平的共有3 類:Stenotrophomonas、Acinetobacter、Escherichia/Shigella。其中Stenotrophomonas在6 個(gè)文庫中均有分布;除YPs3文庫外，Acinetobacter在其余5 個(gè)文庫中均有分布;Escherichia/Shigella 主 要 分 布 于 YSp1、YSp2、BSp1、BSp3 文庫中。此外，渤海春季養(yǎng)殖刺參腸道內(nèi)容物和池塘沉積物歸為厚壁菌門的克隆序列，經(jīng)進(jìn)一步分類分析均屬于Bacillus 屬。

黃海春季文庫中，YSp1和YSp2 文庫中菌群類型組成相似，兩者與YSp3 文庫中菌群類型組成差異較大;渤海春季文庫中，BSp1、BSp2和BSp3 文庫中菌群類型組成相似(圖3)。

圖2 黃、渤海春季刺參腸道及養(yǎng)殖池塘細(xì)菌16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA sequences from the intestine and culture ponds of sea cucumber Apostichopus japonicus from Yellow Sea and Bohai in spring

圖3 黃、渤海春季刺參腸道及養(yǎng)殖池塘的細(xì)菌組成Fig.3 Community compositions of bacteria in the intestine and culture ponds of sea cucumber Apostichopus japonicus from Yellow Sea and Bohai in spring

3 討論

3.1 海水細(xì)菌文庫菌群的結(jié)構(gòu)分析

Jack等［16］對(duì)普利茅斯沿海地區(qū)的海水進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在海水文庫中的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌;關(guān)曉燕等［17］利用16S rDNA PCR -DGGE 技術(shù)對(duì)遼寧省大連、普蘭店灣刺參養(yǎng)殖環(huán)境中菌群多樣性的研究中指出，變形菌是養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌。與前人研究結(jié)果相一致，本研究中黃海和渤海春季刺參養(yǎng)殖池塘海水文庫均以變形菌為優(yōu)勢(shì)類群。比較而言，兩地的養(yǎng)殖池塘海水中菌群類型差異較大，黃海春季刺參養(yǎng)殖池塘海水文庫中除變形菌門外，還含有藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門、擬桿菌門;渤海春季刺參養(yǎng)殖池塘海水文庫中僅能檢測(cè)到變形菌門類細(xì)菌，且在變形菌類群中以γ-變形菌為優(yōu)勢(shì)類群。養(yǎng)殖環(huán)境不同，可能是導(dǎo)致其菌群結(jié)構(gòu)不同的主要原因。

3.2 養(yǎng)殖池塘沉積物細(xì)菌文庫菌群的結(jié)構(gòu)分析

本研究結(jié)果表明，黃海和渤海刺參養(yǎng)殖池塘沉積物文庫中的優(yōu)勢(shì)類群均為變形菌門，這一結(jié)果與近年來有關(guān)海洋沉積物中微生物多樣性的報(bào)道相一致。葛良法［18］的研究顯示，海水養(yǎng)殖池塘沉積物中存在豐富的細(xì)菌類群，變形桿菌為優(yōu)勢(shì)類群;王麗萍等［19］的研究表明，天津新港區(qū)潮間帶地區(qū)的沉積物中變形桿菌為優(yōu)勢(shì)菌;白潔等［20］的研究表明，黃海西北部各站位沉積物中變形菌門類為優(yōu)勢(shì)菌。γ-變形菌具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，它們?cè)诓煌纳鷳B(tài)系統(tǒng)中有著廣泛的分布。閆法軍［21］在研究刺參養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)微生物結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，刺參池塘底泥中γ-變形菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。這一結(jié)果在本研究中也得到證實(shí)。Urakawa等［22］的研究表明，海水中占較大比例的α -變形菌很少在海洋沉積物中被發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果與其相一致，刺參養(yǎng)殖池塘沉積物中均未發(fā)現(xiàn)α -變形菌。

芽孢桿菌是首先應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中的益生菌［23］，益生菌對(duì)養(yǎng)殖刺參的影響目前已有諸多研究。本研究中僅在渤海刺參養(yǎng)殖池塘沉積物文庫中發(fā)現(xiàn)一條克隆序列屬于芽孢桿菌，在黃海刺參養(yǎng)殖池塘沉積物文庫中未檢測(cè)到。而王亞南等［24］研究發(fā)現(xiàn)，福建某近海海水養(yǎng)殖場(chǎng)底泥細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌;李彬等［25］研究也發(fā)現(xiàn)，冬季青島刺參養(yǎng)殖池塘沉積物中的優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌。推測(cè)這可能是養(yǎng)殖環(huán)境和采樣地點(diǎn)不同造成的。

3.3 刺參腸道內(nèi)容物文庫菌群結(jié)構(gòu)及其與外生境菌群結(jié)構(gòu)的比較分析

高菲等［26］利用PCR -DGGE 技術(shù)分析刺參腸道內(nèi)容物細(xì)菌的群落組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，刺參前腸、中腸和后腸內(nèi)容物的優(yōu)勢(shì)菌群均為γ-變形菌。本研究中也發(fā)現(xiàn)，黃海和渤海春季養(yǎng)殖刺參腸道內(nèi)容物文庫中γ - 變形菌為優(yōu)勢(shì)類群，分別占兩文庫的98.02%和92.63%。高菲等［26］所獲得的13 條序列中，12 條與之親緣關(guān)系最近的序列來自從海洋環(huán)境中獲得的細(xì)菌克隆，表明刺參消化道的細(xì)菌群落可能直接或間接來源于刺參的棲息環(huán)境。本研究中所建文庫中，變形菌均為6 個(gè)文庫的優(yōu)勢(shì)門類。相較而言，黃海和渤海養(yǎng)殖刺參的腸道內(nèi)容物與相應(yīng)地點(diǎn)的刺參養(yǎng)殖池塘海水文庫菌群結(jié)構(gòu)差異較大，在黃海刺參養(yǎng)殖池塘海水文庫中除變形菌外，還檢測(cè)到放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門細(xì)菌，且所占比例較大，但這3種菌在黃海刺參腸道內(nèi)容物文庫中均未檢測(cè)到;在渤海刺參腸道內(nèi)容物文庫中除變形菌外，還檢測(cè)到放線菌門和厚壁菌門細(xì)菌，但在渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水文庫中未檢測(cè)到。與此不同的是，本研究中發(fā)現(xiàn)，黃海和渤海刺參腸道內(nèi)容物文庫和刺參養(yǎng)殖池塘沉積物文庫中變形菌均為優(yōu)勢(shì)類群，結(jié)構(gòu)也比較相似。推測(cè)原因，可能是由于刺參攝食無選擇性，在池塘底層攝入大量的底泥、有機(jī)物質(zhì)和細(xì)菌，加之刺參腸道中有穩(wěn)定的細(xì)菌菌群輔助消化［27］，刺參攝入的一些細(xì)菌不能被消化，而是在腸道中定植下來。

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