周賀，徐雯，李雅娟，秦艷杰，李霞，麻天宇，肖逸嘯，馬海艷

(大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023)

表觀遺傳(Epigenetics)是指在基因的DNA序列未發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致表型的變化［1］。DNA 甲基化(DNA methylation)作為表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容，是目前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)技術(shù)，是一種簡單、有效、可靠且能在全基因組水平檢測胞嘧啶甲基化模式及其變化的方法［2］，在生物的DNA 甲基化研究中應(yīng)用廣泛。

多倍化在許多植物和動(dòng)物中普遍存在［3］。泥鰍Misgurnus anguillicaudatus 存在天然多倍體現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，日本的泥鰍除了存在正常有性生殖二倍體外，還存在無性生殖二倍體和雜種生殖三倍體，但未發(fā)現(xiàn)天然四倍體［4-7］。中國的泥鰍存在二倍體、三倍體和四倍體3種不同倍性［8-11］。近年來，本研究室人員對(duì)中國特有的天然四倍體泥鰍的分布［11］、體細(xì)胞染色體核型分析［12］、染色體帶型與FISH 研究［13］、減數(shù)分裂染色體行為［14］、泥鰍細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備［15］等方面進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。從細(xì)胞及分子遺傳學(xué)角度證實(shí)了天然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的同源四倍體，因此，泥鰍是探究同源多倍化機(jī)制的理想試材。已有研究證明，自然或人工合成的異源多倍體在其發(fā)生與形成后的穩(wěn)定過程中都常常伴隨著快速且有時(shí)在進(jìn)化上保守的表觀遺傳變化，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、RNA 干擾等［16］。而且，表觀遺傳修飾在多倍體形成后的二倍化過程中也發(fā)揮了重要作用［17］。相對(duì)于動(dòng)、植物異源多倍化現(xiàn)象，對(duì)同源多倍化過程中遺傳及表觀遺傳變化特征的研究較少。本研究中，作者以泥鰍為研究對(duì)象，利用正交試驗(yàn)建立MSAP 方法的最佳反應(yīng)體系，并利用該方法對(duì)二倍體泥鰍基因組DNA 進(jìn)行MSAP 分析，旨在為探究同源四倍體泥鰍多倍化過程中基于DNA 甲基化的表觀遺傳變化特征，為魚類同源多倍化機(jī)制的研究提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用二倍體泥鰍購自大連市農(nóng)貿(mào)市場，暫養(yǎng)在遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水族箱中，暫養(yǎng)溫度為(22 ±1)℃。二倍體泥鰍的倍性經(jīng)血紅細(xì)胞核測量及流式細(xì)胞儀檢測確定。

試驗(yàn)用主要試劑有限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hpa II、Msp I(Fermentas)，Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司)，氯仿-異戊醇(體積比為24∶1)、EDTA、Tris、尿素、TEMED［生工生物工程(上海)股份有限公司］，引物、接頭［生工生物工程(上海)股份有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用尿素法［18］提取基因組DNA，取適量魚鰭經(jīng)尿素緩沖液消化后，使用氯仿-異戊醇等抽提2次后，經(jīng)100%(體積分?jǐn)?shù)，下同)無水乙醇沉淀，再用70%無水乙醇清洗后獲得DNA。

1.2.2 DNA 濃度與質(zhì)量的檢測 用Eppendorf D30核酸蛋白測定儀測定基因組DNA 的濃度并計(jì)算260 nm 與280 nm 處OD 值的比值，以確定DNA 的純度;用8 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA(180 V，電泳20 min)的質(zhì)量。

1.2.3 MSAP 雙酶切體系的優(yōu)化 選取EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I 兩組內(nèi)切酶分別對(duì)基因組DNA 進(jìn)行酶切。20 μL 體系中包括:800 ng 基因組DNA，10 ×buffer Tango 緩沖液4 μL，EcoR I、Hpa II和Msp I 各10 U，混勻后用PCR 儀溫育酶切，將酶切時(shí)間分別設(shè)定為4、6、8 h，完成后用10 g/L瓊脂糖凝膠檢測酶切產(chǎn)物的質(zhì)量。

1.2.4 MSAP 連接體系 連接體系為30 μL，將接頭等加入酶切液中，于22 ℃下連接2 h，接頭在加入酶切液之前先合為雙鏈。雙酶切剩余量為17 μL，加入5 ×T4 buffer 6 μL，混勻后放入PCR 儀中進(jìn)行連接，引物及接頭設(shè)計(jì)參照曹哲明等［19］的方法，本試驗(yàn)中研究所用的接頭、引物詳見表1。

表1 接頭和引物序列Tab.1 Sequences of adaptors and primers used for MSAP

1.2.5 MSAP 預(yù)擴(kuò)增體系 采用E-A和H-M 引物組合(表1)，反應(yīng)總體積為20 μL。為了確定MSAP 預(yù)擴(kuò)增體系中4 個(gè)因素(預(yù)擴(kuò)模板、引物、dNTPs、Mg2+濃度)的最佳反應(yīng)濃度，選用L9(34)正交表［20］進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。引物濃度及PCR 反應(yīng)程序參照秦艷杰［21］的方法。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃下預(yù)變性2 min;94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火40 s，72 ℃下延伸60 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸5 min，4 ℃下保存。用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20 倍后用作選擇性擴(kuò)增模板，剩余產(chǎn)物于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆?。試?yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 選擇性擴(kuò)增體系 選擇性擴(kuò)增選取E -CC、HM-TC 引物組合(表1)，反應(yīng)總體積為20 μL。為了確定MSAP 選擇性擴(kuò)增體系中4 個(gè)因素(預(yù)擴(kuò)模板、引物、dNTPs、Mg2+濃度)的最佳反應(yīng)濃度，選用L9(34)正交表［20］進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表3)。引物濃度、模板稀釋倍數(shù)和PCR 反應(yīng)程序參照秦艷杰［21］的方法。PCR反應(yīng)程序:94 ℃下預(yù)變性2 min;94 ℃下循環(huán)變性40 s，65 ～56 ℃(每循環(huán)下降0.7 ℃)下退火40 s，在72 ℃下延伸60 s，共進(jìn)行12 個(gè)循環(huán);94 ℃下循環(huán)變性40 s，56 ℃下退火40 s，72 ℃下延伸60 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸5 min，4℃下保存。

1.2.7 泥鰍基因組DNA 甲基化模式分析 選用E-CT/HM-TC和E-CC/HM -TC 兩對(duì)選擇性擴(kuò)增引物(表1)，分別對(duì)3 個(gè)二倍體泥鰍的基因組做MSAP 分析，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物變性后，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染后獲得圖譜，分析其甲基化率。在MSAP 電泳圖上，每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)兩個(gè)泳道，即H 泳道和M 泳道，H 泳道是指利用EcoR I/Hpa II 這組酶處理的樣品，而M 泳道是指利用EcoR I/Msp I 這組酶處理的樣品。每個(gè)樣品的基因組甲基化主要分為:非甲基化，即條帶在兩個(gè)泳道同時(shí)出現(xiàn);全甲基化，即條帶在M 泳道出現(xiàn)而H 泳道缺失;半甲基化，即條帶在H 泳道出現(xiàn)而M 泳道缺失，通過統(tǒng)計(jì)甲基化率來確定樣品的甲基化程度。

表2 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系各成分的因素－水平正交設(shè)計(jì)表Tab.2 Factors－levels of the components for pre－selective amplification orthogonal array

表3 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系各成分的因素－水平正交設(shè)計(jì)表Tab.3 Factors－levels of the components for selective amplification－orthogonal array

2 結(jié)果與分析

2.1 泥鰍基因組DNA 質(zhì)量的檢測

由于MSAP 方法對(duì)泥鰍基因DNA 的質(zhì)量要求較高，因此，提取的泥鰍基因組DNA 條帶清晰，帶型完整，點(diǎn)樣孔無殘留，無RNA(圖1)。使用Eppendorf D30 核酸蛋白測定儀測量DNA 濃度，OD260nm/OD280nm的值為1.8 ～2.0，表明該DNA 完全符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 MSAP 雙酶切體系

使用EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I 兩組限制性內(nèi)切酶分別對(duì)基因組DNA 進(jìn)行酶切，于37 ℃下分別保溫4、6、8 h，用10 g/L 瓊脂糖凝膠檢測酶切產(chǎn)物。由圖2可看出，酶切8 h 的產(chǎn)物相對(duì)酶切4、6 h 較完全，并呈彌散狀態(tài)。后續(xù)試驗(yàn)也表明，酶切8 h 的產(chǎn)物符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖1 基因組DNA 瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA

圖2 基因組DNA 雙酶切的瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA after double digestion

2.3 MSAP 預(yù)擴(kuò)增

根據(jù)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段范圍應(yīng)集中在500 bp 左右且呈彌散狀分布的原則，對(duì)電泳圖中電泳條帶的大小、強(qiáng)弱等進(jìn)行直觀分析。從圖3可見，在不同的處理間由于預(yù)擴(kuò)增模板、預(yù)擴(kuò)引物、Mg2+、dNTPs 加入的量不同，擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。其中，1、2、3、4、5、8 泳道條帶較暗，擴(kuò)增產(chǎn)物較低;7、9 泳道非特異性擴(kuò)增較多;組合6 的擴(kuò)增條帶明顯，且在200 ～700 bp 均勻彌散，在500 bp 左右最亮。因此，確定組合6 為最佳預(yù)擴(kuò)增體系，即模板為4 μL、引物0.8 μL、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+、Taq DNA 酶1 U。

圖3 不同預(yù)擴(kuò)增體系擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of different products of apre－selective amplification

2.4 MSAP 選擇性擴(kuò)增

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果初步篩選用E -CT/HM -TC引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。從圖4可見，在這9 個(gè)正交組合中，1、2、3、4、7和8 泳道產(chǎn)生大量非特異性條帶;第9 泳道相比于第6 泳道，有非特異性條帶產(chǎn)生;第5 泳道相比于第6 泳道，亮度較暗，產(chǎn)物較低。因此，確定組合6 為最佳選擇性擴(kuò)增體系，即稀釋20 倍的模板2 μL、引物1.5 μL、0.375 mmol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+、Taq DNA酶1 U。

2.5 最適MSAP 反應(yīng)體系的驗(yàn)證與應(yīng)用

為驗(yàn)證獲得的最佳泥鰍MSAP 反應(yīng)體系，選取3 個(gè)二倍體泥鰍鰭基因組DNA 樣品在該反應(yīng)體系下進(jìn)行MSAP 分析。擴(kuò)增產(chǎn)物變性后在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染后獲得了清晰、多態(tài)性好的指紋圖譜(圖5)。由表4 數(shù)據(jù)可算出:3 個(gè)樣品 的 全 甲 基 化 率 分 別 為 24.1%、20.8%、22.3%，半 甲 基 化 率 分 別 41.4%、20.8%、33.3%，總甲基化率分別為65.5%、41.6%、55.6%;3 個(gè)樣品的非甲基化率分別為34.5%、58.4%、44.4%。證明該體系能夠應(yīng)用于泥鰍基因組DNA 甲基化模式分析。

圖4 不同選擇性擴(kuò)增體系擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of different products of selective amplification

圖5 E－CC/HM－TC 與E－CT/HM－TC 引物組合對(duì)3種DNA 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染結(jié)果Fig.5 Silver staining of selective amplification products with E－CC/HM－TC and E－CT/HM－TC primer combination

3 討論

20世紀(jì)以來，表觀遺傳學(xué)快速發(fā)展，已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等研究領(lǐng)域的前沿。DNA 甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一。檢測DNA 甲基化的方法有重亞硫酸法、高效液相色譜法(HPLC)、甲基化特異性PCR、基因芯片法、質(zhì)譜或色譜法、甲基化敏感性擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)和基因測序法等［22］，其中MSAP 技術(shù)由于其具有簡便、高效、重復(fù)性好、需樣量小、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于檢測動(dòng)、植物基因組胞嘧啶甲基化水平和模式的研究中［23-25］。近年來，在櫛孔扇貝Chlamys farreri［26］、海 灣 扇 貝Argopecten irradians［26-27］、蝦夷 扇 貝Patinopecten yessoensis［26］、草魚Ctenopharyngodon idellus［19］、刺參Apostichopus japonicas［28］、中國明對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis［29］等多種水產(chǎn)動(dòng)物的基因組甲基化研究中已得到應(yīng)用。

表4 二倍體泥鰍基因組DNA 的甲基化水平Tab.4 Genomic DNA methylation levels of diploid loach

MSAP是基于AFLP 的改良技術(shù)，涉及DNA 提取、酶切、擴(kuò)增、產(chǎn)物電泳檢測等多個(gè)環(huán)節(jié)。在影響MSAP 分析的各個(gè)因素中，基因組DNA 的酶切產(chǎn)物質(zhì)量是決定MSAP 成功的關(guān)鍵。酶切時(shí)間過短，酶切不完全，擴(kuò)增中往往出現(xiàn)高分子量的片段，不能真實(shí)反映基因組甲基化信息;酶切時(shí)間過長，可能會(huì)導(dǎo)致酶對(duì)DNA 的非特異性切割，影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。因此，適當(dāng)?shù)拿盖袝r(shí)間是保證MSAP 試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的前提。為了使模板DNA 得到充分酶切，一般會(huì)加大酶的使用量，但加大酶量將增加試驗(yàn)成本。因此，本研究中重點(diǎn)優(yōu)化了內(nèi)切酶的酶切時(shí)間，結(jié)果表明，酶切時(shí)間為8 h，酶切反應(yīng)充分，避免出現(xiàn)大分子量片段多而密的情況，獲得了清晰可辨的多態(tài)性條帶，便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增也是影響MSAP 的關(guān)鍵步驟。擴(kuò)增的結(jié)果是由擴(kuò)增反應(yīng)中各個(gè)因素綜合作用的結(jié)果，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，引物用量、模板用量、Mg2+濃度、dNTPs 濃度是影響擴(kuò)增結(jié)果的主要因素。因?yàn)橐镉昧窟^低，則產(chǎn)物的量明顯較低，相反，則會(huì)產(chǎn)生非特異性條帶;模板量過低，則條帶較暗，產(chǎn)物量較低;Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果影響也較大，這在選擇性擴(kuò)增中表現(xiàn)的最為明顯，Mg2+過量易產(chǎn)生大量非特異性條帶，相反，不足則易使產(chǎn)量降低;dNTPs可以為反應(yīng)提供能量，dNTPs 濃度過低會(huì)降低產(chǎn)物的產(chǎn)量，而且dNTPs 濃度與Mg2+濃度要相適應(yīng)，否則會(huì)直接影響PCR 結(jié)果。因此，本試驗(yàn)中著重對(duì)泥鰍MSAP 反應(yīng)體系中預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:預(yù)擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系為模板4 μL、引物0.8 μL、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+;選擇性擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系為稀釋20 倍的模板2 μL、引物1.5 μL、0.375 mmol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+。本試驗(yàn)結(jié)果與多數(shù)研究報(bào)道一致［30-32］。用該體系對(duì)泥鰍全基因組DNA 進(jìn)行甲基化水平和模式分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，3 個(gè)二倍體泥鰍個(gè)體之間的甲基化程度存在差異，其原因有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過本試驗(yàn)優(yōu)化后得到了穩(wěn)定、重復(fù)性好的MSAP 體系，為今后探究同源四倍體泥鰍多倍化過程中基于DNA 甲基化的表觀遺傳變化特征奠定了基礎(chǔ)。

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