王偉丞，梁海英，曾智勇*，湯德元，劉 釗

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州大學教學實驗場，貴陽 550025）

γ-干 擾 素 (interferon-gamma，IFN-γ)是由激活的T細胞和NK細胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)細胞生長和免疫功能的分泌型細胞因子[1-2]。IFN-γ具有激活NK細胞Th 1系列的輔助性T細胞以及CD8+T細胞等功能，因而也稱為“免疫干擾素”。許多研究表明IFN-γ不僅能有效抑制病毒增殖且在細胞免疫中也起到重要的作用，具有較好的臨床應(yīng)用前景[3]。隨著對IFN-γ功能研究的深入，目前國內(nèi)也有對豬的γ-干擾素基因研究，但是對純種豬特別是地方純種豬γ-干擾素的研究還比較少。本研究在已構(gòu)建好的含有貴州白香豬γ-干擾素基因的pMD-GZ-IFN-γ質(zhì)?；A(chǔ)上，構(gòu)建其真核表達質(zhì)粒，為研發(fā)新型抗病毒制劑和疫苗佐劑，以及貴州白香豬的疾病防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

pMD-GZ-IFN-γ（由貴州省動物疫病研究室構(gòu)建保存）；pMD19-T Simple Vector〔購自寶生物工程（大連）有限公司〕；真核表達載體pcDNA3.1(+)（購自Invitrogen公司）；大腸桿菌感受態(tài)TOP10（貴州省動物疫病研究室制備和保存）。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(50)膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)陽性質(zhì)粒pMD-GZ-IFN-γ設(shè)計一對特異性引物P1和P2，分別在其兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，擴增用于表達的IFN-γ基因片段。

P1：5-CGGGATCCATGAGTTA TACAACTT-3；

P2：5-CGGAATTCTTATTTTG ATGCTCT-3。

為了便于克隆，分別在其兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點（劃線部分）預(yù)期擴增大小為520 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 IFN-γ基因PCR擴增

以pMD-GZ-IFN-γ質(zhì)粒DNA為模版，用引物P1和P2進行IFN-γ基因擴增。PCR反應(yīng)體系：pMD-GZIFN-γ1 μL，上下游引物各 2 μL，2×Taq PCR Mastermixture25 μL，ddH2O 0.5 μL。按以下條件進行反應(yīng)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35cycles；72 ℃ 10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple Vector載體按常規(guī)方法進行連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TOP10。挑取白色菌落進行增菌培養(yǎng)，小劑量試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用質(zhì)粒PCR和酶切分別進行鑒定，并將陽性克隆質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司測序，命名為pMD19-IFN-γ。

1.6 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對pMD19-IFN-γ測序質(zhì)粒及載體pcDNA3.1(+)分別進酶切，回收純化目的片段，將二者用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ，分別進行雙酶切及質(zhì)粒PCR鑒定后，并送寶生物工程（大連）有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增

以pMD-GZ-IFN-γ陽性質(zhì)粒為模板，用設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增IFN-γ基因，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳呈單一條帶，大小與預(yù)期片段520 bp相符（圖1）。

2.2 克隆質(zhì)粒pMD19-IFN-γ的鑒定

圖1 IFN-γ的PCR擴增產(chǎn)物

圖2 pMD19-IFN-γ的鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pMD19-IFN-γ經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，均獲得大小約520 bp的與預(yù)期片段大小一致的DNA片段（圖2）。

2.3 真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ的鑒定

p c D N A 3.1(+)-I F N-γ經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)2條大小分別為5 400 bp和520 bp的目的DNA片段；以pcDNA3.1(+)-IFN-γ為模版，經(jīng)PCR擴增，在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)一條大小約520 bp的條帶（圖3）。

由pcDNA3.1(+)-IFN-γ重組質(zhì)粒DNA測序結(jié)果可知，IFN-γ基因已亞克隆至pcDNA3.1(+)真核表達載體中，其開放閱讀框為501 bp，可編碼166個氨基酸，該序列與pMD-GZIFN-γ中IFN-γ序列（GenBank登錄號：JF906510）完全一致。

圖3 pcDNA3.1(+)-IFN-γ的鑒定結(jié)果

3 討論

干擾素是由細胞分泌的一類具有廣譜抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能的新型藥物，應(yīng)用前景較為廣泛，主要著重于調(diào)節(jié)機體免疫功能，且其副作用少，因而在多種疾病的治療上具有傳統(tǒng)藥物所不可替代的作用。干擾素還具有疫苗佐劑的作用，其不僅能特異性的增強疫苗的免疫效果，而且還可增強機體抗感染的能力[4]。

近年來，國內(nèi)不斷有用基因工程技術(shù)表達γ-干擾素的報道。婁忠子等構(gòu)建了IFN-γ原核表達系統(tǒng)并在大腸桿菌系統(tǒng)實現(xiàn)了高效表達[5]。姚清俠等運用腺病毒載體，通過同源重組，首次成功研制了攜帶豬γ-干擾素的重組腺病毒[6]。目前基因工程生產(chǎn)細胞因子主要有原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)2種，因真核表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)目的蛋白的分泌表達，且表達的蛋白不需要修飾，具有生物活性，而原核表達系統(tǒng)表達的目的蛋白常以包涵體形式存在，且翻譯后加工修飾不完善，影響蛋白生物活性，所以真核表達系統(tǒng)產(chǎn)生細胞因子越來越受到重視[7]。

本研究中采用的pcDNA3.1(+)真核表達載體，攜帶有CMV強啟動子，能夠攜帶外源基因在哺乳動物細胞中高效轉(zhuǎn)錄表達。對pcDNA3.1(+)-IFN-γ質(zhì)粒的測序表明，γ-干擾素基因已亞克隆至pcDNA3.1(+)中，成功構(gòu)建了γ-干擾素真核表達載體，為IFN-γ基因的真核表達研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] 曾智勇，周莉，劉志杰，等. 貴州白香豬γ干擾素基因的克隆與序列分析[J].貴 州 農(nóng) 業(yè) 科 學， 2012，40 (08)： 151-153.

[2] 楊生海，殷宏，劉永生，等. 干擾素-γ研究進展[J]. 生物技術(shù)通報 ，2010(08)：29-34.

[3] 夏倫斌，王新華，連宏軍，等. γ干擾素及其在動物疾病防控中的應(yīng)用[J]. 動物醫(yī)學進展 ，2007，28(05)：74-78.

[4] 溫納相，陳瑞愛，裴仉福，等. 新興豬γ-干擾素基因克隆及其真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 [J]. 動物醫(yī)學進展， 2005， 26(09)：74-77.

[5] 婁忠子，蘭喜，李建強，等. 豬γ-干擾素的克隆表達及單抗的潛在應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2010(01)： 173-179.

[6] 姚清俠，徐卓菲，何雁南，等. 表達豬γ干擾素的重組腺病毒的構(gòu)建和活性鑒定 [J]. 病毒學報， 2007， 24(05)： 394-398.

[7] 肖紅冉，王大偉，賀志銳，等. 豬α干擾素在BHK-21細胞中的表達與生物活性分析[J]. 石河子大學學報：自然科學版 ，2013， 31(02)：182-186.