劉媛媛，鄭永杰，田景芝

（齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006）

改性硅藻土對脂肪酶固定化研究*

劉媛媛，鄭永杰*，田景芝

（齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006）

以改性硅藻土為載體，采用吸附法對脂肪酶進(jìn)行固定化。對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化。得到較佳的固定化條件：固定化時間為4h；溫度為40℃；pH值為7.5；固定化酶在40℃下保溫2h后酶活損失很小，固定化酶重復(fù)性達(dá)到最佳狀態(tài)。

改性硅藻土；固定化；脂肪酶

脂肪酶（lipase,EC 3.1.1.3，甘油酯水解酶）是具有?；鶊F(tuán)可做生物催化劑的一種水解酶，在醫(yī)藥[1]、食品加工[2]、生物能源[3]上有廣泛的應(yīng)用。但是游離酶不易回收，很難反復(fù)利用，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。固定化酶可有效反復(fù)使用，使工業(yè)生產(chǎn)降低成本[4]；吸附法的優(yōu)勢在于工藝簡單，操作條件溫和、不易破壞酶分子的高級結(jié)構(gòu)以及活性中心的構(gòu)象，酶活回收較高；張軍等[5]對18種不同的無機(jī)和有機(jī)載體對脂肪酶進(jìn)行固定化，發(fā)現(xiàn)硅藻土是比較好的固定化載體。

脂肪酶在載體表面的吸附數(shù)量取決于它們之間的靜電平衡[6,7]。在對脂肪酶固定化時我們發(fā)現(xiàn)由于受孔徑的限制，不是所有的多孔載體都能應(yīng)用于酶的固定化，相反，如果想獲得高負(fù)載酶量和保持高酶活力得率，對載體內(nèi)部的幾何結(jié)構(gòu)的要求是肯定的。但是硅藻土原礦雜質(zhì)較多、理化結(jié)構(gòu)存在缺陷，這些因素極大地限制了硅藻土吸附性能的發(fā)揮。

本文采用焙燒法[8]先對硅藻土進(jìn)行改性，在高溫環(huán)境下，硅藻土表面羥基會發(fā)生對硅藻土吸附性有很大影響的轉(zhuǎn)化。再用堿浸法對硅藻土進(jìn)行提純，改性硅藻土固定化脂肪酶對酶活、反復(fù)利用率上有很大程度提高。

1 實驗部分

1.1 材料及儀器

脂肪酶（lipase）（10萬U·g-1，阿拉丁試劑）；橄欖油（A.R.）；硅藻土（阿拉丁試劑）；NaH2PO4，Na2HPO4均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯醇（PVA）（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠）；石油醚（A.R.）。

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AR1140/C電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；Nicolet6700傅立葉變換紅外色譜儀（美國尼高力儀器公司）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；S-4300場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（金壇市中大儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酶酶液配制將脂肪酶溶于pH值為7的緩沖溶液中，用實驗室高剪切分散乳化機(jī)攪拌，抽濾，取上清液定容，配制一定濃度的酶液。

1.2.2 脂肪酶水解活力的測定采用橄欖油乳化法測定游離脂肪酶和固定化脂肪酶的活力。脂肪酶在一定條件下能使甘油三酯水解成脂肪酸等，用標(biāo)準(zhǔn)堿進(jìn)行中和滴定，用pH計確定反應(yīng)終點，根據(jù)消耗堿量，計算酶活力。

1.2.3 脂肪酶蛋白質(zhì)含量測定紫外可見分光光度計法是利用物質(zhì)的分子或離子對某一波長范圍的光的吸收作用，對物質(zhì)進(jìn)行定量、定性分析。在紫外可見光的范圍內(nèi)，對于一個特定的波長，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)的濃度、液層厚度乘積成正比，即Lambert-Beer定律。

Lambert-Beer定律顯示吸光度與吸收池厚度成正比，與溶液濃度成正比，即

式中A：吸光度；ε：摩爾吸光系數(shù)；c：溶液濃度，mol·L；l：液池厚度，cm。

可以通過這個定律在掃描光譜中的最大吸收波長來對脂肪酶溶液進(jìn)行定性分析。此文用TU-1900雙光束紫外可見分光光度計來測定固定化酶量，游離酶的含量。

1.2.4 硅藻土的改性

硅藻土的焙燒改性：硅藻土在300、450、600℃培燒2h進(jìn)行熱活化，再在105℃下活化1h，干燥冷卻，即得到不同溫度焙燒改性硅藻土。在相同條件下固定化脂肪酶，活性最高者所對應(yīng)的溫度為最適溫度。選取該條件下熱活化的硅藻土進(jìn)行堿浸處理。

硅藻土的堿浸處理：將清洗后的載體放入60℃的1mol·L-1NaOH水溶液中孵育1h,超純水清洗3次,室溫晾干。

1.3.5 固定化脂肪酶的制備在一定濃度，一定pH的酶液中加入改性硅藻土，攪拌均勻，恒溫水浴震蕩一定時間后，抽濾，用石油醚清洗固定化的載體3次，使載體顆粒分散均勻，抽真空干燥。

2 結(jié)果與討論

2.1 載體對固定化酶活影響

A是未改性硅藻土，A1、A2、A3分別是300、450、600℃培燒改性硅藻土，B是先經(jīng)450℃焙燒后堿浸的改性硅藻土。對不同載體固定脂肪酶進(jìn)行酶活測定。以不同種類硅藻土做橫坐標(biāo)，固定化酶活為縱坐標(biāo)做圖1。

圖1 不同改性硅藻土對酶活影響Fig.1 Different modified diatomite enzyme and immobilized enzyme activity

由1圖可知，改性后硅藻土對于脂肪酶酶活有一定程度提高。

2.2 固定化酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 溫度對酶活的影響酶的本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，受這種屬性的影響，溫度對酶的影響非常敏感，在其他條件相同的情況下，溫度是可以改變載體的吸附量，而且蛋白質(zhì)在高溫中會變質(zhì)。溫以酶活最高者為100%，以溫度為橫坐標(biāo)，以相對酶活為縱坐標(biāo)作圖2。

圖2 溫度對游離酶和固定化酶活性影響Fig.2 Temperature effect on the free on enzyme activity effect

由圖2可見，在30～70℃這個范圍內(nèi)進(jìn)行溫度對游離態(tài)的脂肪酶和固定化的脂肪酶活性進(jìn)行研究，游離酶在30～35℃這個溫度范圍內(nèi)活性呈上升趨勢的，35℃達(dá)到活性最高，35～70℃活性呈下降趨勢。固定化酶在30～40℃這個溫度范圍內(nèi)活性是呈上升趨勢，40℃達(dá)到活性最高，40～70℃活性呈下降趨勢。

2.2.2 pH對酶活影響在固定化酶的過程中，介質(zhì)pH值因為等電點的原因決定了酶的凈電荷，同時也影響了載體的電荷量。當(dāng)溶液pH值超出一定范圍時，微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，從而引起酶變性失活。因此緩沖液pH值是影響固定化脂肪酶催化活力和載體吸附蛋白量的關(guān)鍵因素之一。以酶活最高者為100%，以pH值為橫坐標(biāo)，以相對酶活為縱坐標(biāo)作圖3。

圖3 pH對游離酶和固定化酶活影響Fig.3 pH influence on free enzyme and immobilized enzyme activity

由圖3可見，游離酶的pH值為5.5～7.0時，酶活呈上升趨勢，當(dāng)pH值為7時，活性最佳。pH為7.0～8.0時活性呈下降趨勢。固定化酶的pH值為5.5～7.5時，酶活呈上升趨勢，當(dāng)pH值為7.5時，活性達(dá)到最佳狀態(tài)。pH值為7.5～8.0時活性呈下降趨勢。

2.3 固定化條件篩選

2.3.1 時間對固定化的影響時間的長短對固定化脂肪酶活力和載體吸附蛋白量也產(chǎn)生影響。以酶活最高者為100%，以時間為橫坐標(biāo)，以相對酶活為縱坐標(biāo)作圖4。

圖4 時間對固定化酶酶活影響Fig.4 Time effect on immobilized enzyme activity

由圖4可見，在pH值為7.5條件下，固定化時間為1～4h時，呈上升趨勢，4h時達(dá)到最佳狀態(tài)，在4～8h時，活性呈下降趨勢。

3 固定化脂肪酶表征

3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

如圖5所示，在放大2000倍條件下未改性硅藻土固定化脂肪酶與改性硅藻土固定化脂肪酶的掃描形貌圖，改性硅藻土孔徑更為清晰通透，排列規(guī)整，一定面積的孔數(shù)量顯明顯增加，因此有效改善了硅藻土的吸附性能。

圖5 硅藻土固定脂肪酶與改性硅藻土固定化脂肪酶電鏡圖（×2000）Fig.5 SEM graph of diatomite immobilized lipase and Modified diatomite immobilized lipase（×2000）

3.2 紅外光譜分析

改性硅藻土固定化酶、硅藻土固定化酶、游離脂肪酶有不同的基團(tuán)，紅外吸收有差異，但固定化酶由脂肪酶與不同載體構(gòu)成，紅外吸收亦有相同之處，三者紅外分析譜圖見圖6。

圖6 改性硅藻土固定化酶、硅藻土固定化酶、游離酶紅外譜圖Fig.6 Immobilized enzyme of modified diatomite/Immobilized enzyme of modified diatomite/Free enzyme

由圖6可見，游離脂肪酶的紅外圖譜中3435cm-1處的吸收峰為-NH的伸縮振動，2978、2920cm-1處的吸收峰為甲基或者亞甲基的伸縮振動峰，在固定化脂肪酶上都出現(xiàn)了脂肪酶在2978、2920cm-1處的特征吸收峰，但是未改性的硅藻土特征峰并不明顯，而改性硅藻土特征峰明顯，表明改性硅藻土固定化優(yōu)于未改性硅藻土。

4 結(jié)論

采用改性硅藻土固定化脂肪酶具有工藝流程簡單、操作方便、反應(yīng)條件較為溫和。固定化時間為4h；由實驗結(jié)果可知酶的最佳固定化條件:溫度為40℃；pH值為7.5；固定化酶在40℃下保溫2h后酶活損失很小，固定化酶熱穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性比游離酶明顯提高，具有較好的操作穩(wěn)定性。

Study on modified diatomite for lipase immobilization*

LIU Yuan-yuan，ZHENG Yong-jie*，TIAN Jing-zhi
（College of Chemistry and Chemistry Engineering,Qiqihaer University,Qiqihaer 161006，China）

The lipase was immobilized by adsorption method with modified diatomite as carrier.The optimized conditions were immobilized time is 4h,temperature is 40℃,pH value is 7.5.The results showed that enzyme activity loss was little when under 40℃and heat preserved 2h.The immobilized enzyme repeatability achieve the best.

modified diatomite；immobilization；lipase

Q814.2

A

1002-1124（2014）03-0014-04

2013-12-26

齊齊哈爾大學(xué)青年教師科研啟動支持計劃資助（2010K-M 24）；黑龍江省教育廳資助項目（12521612）

劉媛媛（1988-），女，黑龍江省伊春市，在讀碩士研究生。

鄭永杰（1964-），男，黑龍江省同江縣，工學(xué)博士，教授，分析化學(xué)學(xué)科和生物化工學(xué)科研究生導(dǎo)師，主要研究方向：儀器分析及其聯(lián)用技術(shù)、吸附材料及其應(yīng)用、環(huán)境污染物動態(tài)遷移轉(zhuǎn)化研究。