史三寶，紀(jì)冬梅，陳蓓麗，郝 燕，陳大蔚，周 平，章志國(guó)，曹云霞

維生素C提高小鼠體細(xì)胞核移植胚胎的發(fā)育潛能

史三寶，紀(jì)冬梅，陳蓓麗，郝 燕，陳大蔚，周 平，章志國(guó)，曹云霞

探討不同濃度維生素C和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小鼠體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育潛能的影響。不同濃度維生素C（0、50、100 mg／L）分別處理小鼠核移植重構(gòu)胚，50 mg／L維生素C濃度組處理重構(gòu)胚18 h，獲得的囊胚率以及胚胎著床率顯著高于其他組（P＜0.05），且在此基礎(chǔ)上提高維生素C濃度或處理時(shí)間不能進(jìn)一步提高克隆胚的發(fā)育潛能（P＞0.05）。小鼠體細(xì)胞核移植胚胎培養(yǎng)時(shí)，適當(dāng)?shù)木S生素C濃度和培養(yǎng)時(shí)間可顯著提高小鼠重構(gòu)胚的發(fā)育潛能。

維生素C；體細(xì)胞；核移植；胚胎；發(fā)育潛能

體細(xì)胞核移植動(dòng)物不僅可以用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，還可用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域核移植胚胎干細(xì)胞替代治療疾病。雖然體細(xì)胞核移植哺乳動(dòng)物早在上個(gè)世紀(jì)就已被成功報(bào)道［1］，而且近年來(lái)已開展了很多關(guān)于提高小鼠體細(xì)胞核移植克隆效率的相關(guān)研究［2］，但是仍然沒(méi)有太多的進(jìn)展［3－4］。維生素C是許多動(dòng)物的一種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是有效的抗氧化劑［5］。最近研究［6］顯示，維生素C可以提高小鼠和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）產(chǎn)生效率，促進(jìn)部分重新編程iPS細(xì)胞過(guò)渡至完全重編程狀態(tài)，并且可能是通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)抑癌基因p53的完全表達(dá)來(lái)提高細(xì)胞重編程效率。因此，維生素C促進(jìn)細(xì)胞重編程是安全的。該研究旨在探討維生素C也可能改善小鼠體細(xì)胞核移植克隆效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)F1（C57BL*CBA）雜交鼠，68周齡，20～26 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 試劑與儀器培養(yǎng)液G-Gamete、G-1plus、G-2plus購(gòu)自瑞典Vitrolife公司；透明質(zhì)酸酶、氯化鍶（SrCl2）、礦物油、細(xì)胞松弛素B（cytochalasin B，CB）、無(wú)鈣CZB液、胎牛血清（BSA）等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；7%聚乙烯吡咯烷酮（7%PVP）購(gòu)自美國(guó)Sage公司；孕馬血清（PMSG）及人絨毛膜促性腺激素（hCG）購(gòu)自寧波生物工程有限公司。拉針儀（PN-300型）、磨針儀（EG-40型）、電融合儀（ECM2001，BTX）、玻璃管及機(jī)械針（G-100）購(gòu)自澳大利亞CryoLogic公司；倒置顯微鏡（CE-2000，Nikon）、顯微操作系統(tǒng)（IX-71）購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 卵子促排6～8周齡的雌性F1（C57BL* CBA）雜交鼠，光照12 h／d，自由攝食飲水。腹腔注射7.5 IU PMSG，46～48 h后腹腔注射7.5 IU hCG，17.5 h時(shí)頸椎脫臼處死，取出卵丘卵團(tuán)復(fù)合體，37℃、0.08 IU／L透明質(zhì)酸酶消化3 min去除顆粒細(xì)胞，取表明光滑、胞漿質(zhì)地均勻的卵子置于G-Gamete液滴中備用。

1.4 顯微操作針

1.4.1 持卵針 將事先制備出的機(jī)械針于直徑80 ～90 μm處切割并將末端烤成均勻鈍圓，使其外徑為80～90 μm，內(nèi)徑為13～15 μm。

1.4.2 去核針 將事先制備出的機(jī)械針在? 10 μm處切割并將其相對(duì)磨針儀30度角固定，加適量無(wú)水乙醇，調(diào)整磨針儀轉(zhuǎn)速，磨針3 min；然后垂直于鍛針儀電熱絲正上方，緩慢加熱電熱絲，勻速調(diào)整玻璃針，烤平去核針內(nèi)管口，使內(nèi)徑為8～10 μm，外徑為10～12 μm。

1.4.3 注射針 參照去核針，注射針外徑約為7 μm，內(nèi)徑約為5 μm。

1.5 體細(xì)胞核移植方法

1.5.1 去核 本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用透明帶打孔法。將事先選好的卵子置于顯微操作液滴A（G-Gamete＋5 μg／ml CB）里，用持卵針及去核針調(diào)整卵子的位置，第一極體位于12點(diǎn)時(shí)持卵針固定，將原始機(jī)械針由卵子1點(diǎn)位置刺入，11點(diǎn)刺出，然后持卵針釋放卵子，并用機(jī)械針與持卵針?lè)磸?fù)摩擦，使卵子從機(jī)械針上自動(dòng)脫落。再次調(diào)整卵子使核位于3點(diǎn)鐘位置固定，去核針負(fù)壓勻速吸除極體及周圍卵核質(zhì)［10］，見(jiàn)圖1A。

1.5.2 注核 將去核后的卵子置于G-1液滴中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，然后移入顯微操作液B（G-Gamete）中注核。同時(shí)用注射針于PVP液滴中處理顆粒細(xì)胞，將吸有破膜顆粒細(xì)胞的注射針由去核路徑注入卵黃膜內(nèi)，見(jiàn)圖1B。

1.6 重構(gòu)卵的激活與培養(yǎng)

1.6.1 激活 將注核后的重構(gòu)卵移入事先制備的10 mmol／L SrCl2＋5 μg／ml CB＋10%BSA的無(wú)鈣CZB中激活約5 h，并繼續(xù)在含5 mg／L CB的G-1 Plus中培養(yǎng)3 h，當(dāng)重構(gòu)卵胞質(zhì)中出現(xiàn)類原核或分裂為2-細(xì)胞且各含1個(gè)原核時(shí)，確定為激活成功［11］。

1.6.2 培養(yǎng) 將成功激活的一部分重構(gòu)卵分3組移入0、50、100 mg／L維生素C的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)小鼠重構(gòu)胚18 h，換液培養(yǎng)觀察重構(gòu)胚的發(fā)育情況并記錄。在50 mg／L維生素C基礎(chǔ)上將另一部分重構(gòu)卵再分3組，一組為無(wú)維生素C對(duì)照，另兩組統(tǒng)一在50 mg／L維生素C培養(yǎng)液分別培養(yǎng)18 h和36 h后再換液，觀察并記錄囊胚發(fā)育情況。

1.7 重構(gòu)胚移植核移植胚胎發(fā)育2.5 d時(shí)制備ICR母鼠為假孕受體，3.5 d時(shí)將核移植發(fā)育得到的囊胚移植至雙側(cè)子宮內(nèi)，移植時(shí)小鼠全身麻醉，移植后恢復(fù)2～3 h，待小鼠清醒后再進(jìn)食。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各種率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 囊胚發(fā)育情況不同維生素C濃度和處理時(shí)間組均獲得了核移植優(yōu)質(zhì)囊胚，見(jiàn)圖1C。

2.2 不同維生素C濃度處理組的胚胎發(fā)育50 mg／L維生素C組的小鼠克隆胚的卵裂及囊胚率顯著高于不含維生素C組（P＜0.01），但進(jìn)一步提高維生素C濃度并沒(méi)有進(jìn)一步提高重構(gòu)胚的發(fā)育率，見(jiàn)表1。

表1 不同維生素C濃度下重構(gòu)胚的發(fā)育情況［n（%）］

2.3 不同維生素C處理時(shí)間組的胚胎發(fā)育重構(gòu)胚移入含有濃度為50 mg／L維生素C培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0、18、36 h得出，維生素C中培養(yǎng)18 h組小鼠重構(gòu)胚的卵裂及囊胚率均顯著高于0 h組（P卵裂＜0.01，P囊胚＜0.05），將維生素C處理時(shí)間從18 h延長(zhǎng)至36 h并沒(méi)有進(jìn)一步提高胚胎發(fā)育率。見(jiàn)表2。

表2 50 mg／L維生素C下不同處理時(shí)間重構(gòu)胚的發(fā)育情況［n（%）］

2.4 胚胎移植本研究用ICR假孕母鼠為受體，共移植小鼠核移植重構(gòu)胚360枚，其中未處理160枚，移植4只受體，維生素C培養(yǎng)18 h組200枚，移植5只受體，平均每只受體移植40枚核移植胚胎，并與移植后第9天處死代孕母鼠，檢查子宮內(nèi)著床情況，最終維生素C組3只見(jiàn)著床點(diǎn)（60%），見(jiàn)圖1D，未處理組僅1只見(jiàn)著床點(diǎn)（25%）。

圖1 體細(xì)胞核移植去核與注核以及重構(gòu)胚體內(nèi)外發(fā)育情況

3 討論

本研究中，小鼠克隆胚胎在維生素C濃度為50 mg／L的培養(yǎng)液中處理18 h囊胚發(fā)育率顯著高于未處理組?？赡苁怯捎诰S生素C改善了克隆胚培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件。據(jù)研究［5］報(bào)道，抗壞血酸在某些培養(yǎng)體系中可以作為有效的抗氧化劑。另一方面，延長(zhǎng)維生素C處理時(shí)間至36 h并沒(méi)有提高囊胚率，這表明維生素C處理18 h可以提高著床前胚胎的發(fā)展?jié)摿ΑＶ貥?gòu)胚起始的18 h也是被公認(rèn)的分化細(xì)胞細(xì)胞核重編程激活的時(shí)間窗［7］。同時(shí)也顯示出，后期補(bǔ)充維生素C不能進(jìn)一步提高囊胚形成率，雖然囊胚率也高于未處理組。

哺乳動(dòng)物克隆重構(gòu)胚的不完全重編程是主要的技術(shù)缺陷［7］。組蛋白乙?；呛艘浦仓泄w細(xì)胞和受體胞質(zhì)中的關(guān)鍵表觀遺傳標(biāo)記，而且組蛋白H4已經(jīng)被證明直接誘導(dǎo)核染色質(zhì)更精確的組裝［8］。本研究用50 mg／L維生素C處理小鼠體細(xì)胞克隆胚胎18 h，顯著提高了重構(gòu)胚的發(fā)育潛能，可能是維生素C在一定程度上提高了重構(gòu)胚內(nèi)相關(guān)因子的表達(dá)水平。

雖然胚胎在體外發(fā)育至囊胚階段能力已被用來(lái)作為預(yù)測(cè)體細(xì)胞核移植的效率，但是體外培養(yǎng)階段的胚胎，通常不能預(yù)測(cè)胚胎的體內(nèi)妊娠結(jié)局［9］。因此，本研究中也做了胚胎移植，得到的結(jié)果是維生素C組的著床率（60%）顯著高于正常對(duì)照組（25%），進(jìn)一步證實(shí)維生素C還可以提高小鼠體細(xì)胞核移植胚胎的著床率。

維生素C可顯著提高小鼠體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率，促進(jìn)核移植胚胎在子宮內(nèi)的著床，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Vitamin C enhanced the potential of mouse somatic cell nuclear transfer embryos

Shi Sanbao，Ji Dongmei，Chen Beili，et al
（Center of Human Reproductive Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

To investigate the impact of different concentrations and time of vitamin C on mouse somatic cell nuclear transfer embryo development potential.Mice reconstructed embryos were treated with different concentrations（0，50，100 mg／L）of vitamin C，the blastocyst and implantation rate was significantly higher than the other groups when this embryos were treated with 50 mg／L concentrations of vitamin C for 18 h（P＜0.05），on the basis of this condition，developmental potential of cloned embryos could not be further enhanced either by increasing the concentration of vitamin C or by prolonging the processing time（P＞0.05）.Appropriate concentrations and incubation time of vitamin C could significantly improve the developmental potential of reconstructed embryos in the process of mouse somatic cell nuclear transfer.

vitamin C；somatic cell；nuclear transfer；embryo；development potential

R 394.2

1000－1492（2014）05－0679－03

2013－12－10接收

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年培育基金（編號(hào)：3101005002061）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81370691）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，合肥 230022

史三寶，男，碩士研究生；

曹云霞，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：caoyunxia6＠126.com；

章志國(guó)，男，研究員，責(zé)任作者，E-mail：zzg100ster＠gmail.com