徐林杰，吳繼雄，許邦龍，王曉晨，彭曉云，何非

急性冠脈綜合征患者外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及意義

徐林杰，吳繼雄，許邦龍，王曉晨，彭曉云，何非

目的探討急性冠脈綜合征（ACS）患者外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的變化及意義。方法收集行冠狀動(dòng)脈造影檢查的住院患者96例，按照1979年WHO冠心病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為3組：ACS 組48例、穩(wěn)定性心絞痛（SAP）組24例、正常對照組24例。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組患者外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞水平，同時(shí)檢測并比較各組患者超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、外周血白細(xì)胞（PWBC）計(jì)數(shù)水平。結(jié)果ACS組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例［（3.18± 1.76）%］顯著低于正常對照組［（5.64±1.63）%］和SAP組［（5.60±1.56）%］（F＝25.247，P＜0.01），而ACS組外周血hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)水平明顯高于正常對照組和SAP組（P＜0.05）。此外，患者外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例的下降與hs-CRP和PWBC計(jì)數(shù)的升高呈負(fù)相關(guān)（r分別為－0.518、－0.311，P＜0.01）。結(jié)論ACS患者外周血中Treg細(xì)胞比例的下降可能通過破壞外周免疫耐受平衡和激活炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。

急性冠脈綜合征；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；超敏C反應(yīng)蛋白；白細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

隨著人們生活水平的不斷提高，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升。急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）發(fā)病急、病情危重、死亡率高，是臨床常見的心血管急重癥，包括不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）和急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）［1］。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是其主要的病理性基礎(chǔ)，目前認(rèn)為AS是一種慢性炎癥性疾病，免疫細(xì)胞尤其是CD4＋T細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg細(xì)胞）是一組特殊的具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能的CD4＋T細(xì)胞亞群，在AS和ACS發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段均發(fā)揮著重要的作用。近年來相關(guān)研究［2］表明ACS患者外周血CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量減少。CD127作為Treg細(xì)胞新的表面標(biāo)志物，在ACS中的研究較少，因此通過標(biāo)記CD127，采用流式細(xì)胞儀檢測ACS組、穩(wěn)定性心絞痛（stable angina pectoris，SAP）組和正常對照組外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞水平的變化，及其與超敏C反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、外周血白細(xì)胞（peripheral white blood cell，PWBC）計(jì)數(shù)之間的關(guān)系，探討免疫調(diào)節(jié)因素在ACS中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2012年8月～2013年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科行冠狀動(dòng)脈造影等檢查的住院患者96例，按照1979年WHO冠心病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，其中ACS組48例，包括AMI 18例和UA 30例；SAP組24例；經(jīng)臨床癥狀、心電圖、經(jīng)胸心臟彩色多普勒超聲、冠狀動(dòng)脈造影檢查排除其他器質(zhì)性心臟疾病的正常對照組24例。所有患者均排除腫瘤、感染、自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病及近期服用免疫抑制劑。

1.2 試劑與儀器藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗人CD127單抗（克隆號hiL-7R-M21）、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD25單抗（克隆號U7.27）和PE-Cy5-CD4同型陰性對照試劑購自美國Beckman-Coulter公司；溶血?jiǎng)?.83%的氯化銨溶液，由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液病實(shí)驗(yàn)室用去離子蒸餾水自行配制。流式細(xì)胞儀為美國Beckman-Coulter公司FC500系列，熒光激發(fā)光波長為488 nm 和633 nm，分析軟件為CXP系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清生化檢測 所有患者常規(guī)檢測血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂，同時(shí)采用免疫散射比濁法測定hs-CRP。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞的百分率 患者均于夜間禁食12 h后清晨空腹平臥位、嚴(yán)格無菌操作采集肘靜脈血2 ml，肝素抗凝，4 h內(nèi)送檢血液病學(xué)實(shí)驗(yàn)室行流式細(xì)胞儀檢測。檢測時(shí)首先根據(jù)前向（FSC）和側(cè)向（SSC）散射光信號對淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，每份標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞在10 000個(gè)以上。將收集的全血1 500 r／min離心5 min，棄上清液，留取沉淀細(xì)胞并打散，加入PBS，再反復(fù)離心洗滌3次，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為（1～6）×106／ml。采用三色直接免疫熒光標(biāo)記法：首先取2支試管分別加入抗凝全血100 μl，其中一管加入CD25-FITC、CD127-PE以及CD4-PC5-Cy5單抗各10 μl，另一管則作為對照管加入CD4-PC5-Cy5、FITC-IgG1和各單抗相對應(yīng)的同型對照PE 10 μl，充分混勻后室溫下避光孵育15 min，加入1 ml溶血?jiǎng)?7℃水浴箱內(nèi)放置10 min左右，待完全溶血后立刻上流式細(xì)胞儀檢測，檢測后數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)的計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料間比較采用χ2檢驗(yàn)，部分指標(biāo)采用Pearson直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料的比較各組年齡、性別、吸煙、高血壓、空腹血糖（Glu）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）等冠心病危險(xiǎn)因素的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ACS組和SAP組高密度脂蛋白（HDL）水平明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而ACS組和SAP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組外周血Treg細(xì)胞檢測的比較ACS組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例明顯低

圖1 各組Treg細(xì)胞的流式檢測圖

表1 各組一般情況（±s）

表1 各組一般情況（±s）

與正常對照組比較：※※P＜0.01

項(xiàng)目正常對照組（n＝24）SAP組（n＝24）ACS組（n＝48）F／χ2值P值男／女（例）15／915／934／140.7500.687高血壓（例）915304.5710.102糖尿?。ɡ?15300.6430.725吸煙（例）815185.2360.073年齡（歲）58.63±10.3456.88±9.0961.77±10.192.1370.124 Glu（mmol／L）5.50±0.665.73±0.525.60±1.180.3500.706 TC（mmol／L）3.86±0.843.99±1.213.62±1.061.1190.331 TG（mmol／L）1.14±0.451.09±0.520.91±0.601.6910.190 LDL-c（mmol／L）2.43±0.592.32±1.052.41±0.870.1440.866 HDL（mmol／L）1.30±0.320.84±0.41※※0.91±0.35※※11.8940.000

于正常對照組和SAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），SAP組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2、圖1。ACS組外周血Treg細(xì)胞／CD4＋CD25＋CD127high比值低于正常對照組（P＜0.01），而SAP組和正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組外周血流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（±s）

表2 各組外周血流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（±s）

與正常對照組比較：※※P＜0.01；與SAP組比較：＃＃P＜0.01

項(xiàng)目正常對照組（n＝24）SAP組（n＝24）ACS組（n＝48）F值P值CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例（%）25.247 0.000 CD4＋CD25＋CD127high占CD4＋細(xì)胞比例（%）5.64±1.635.60±1.56 3.18±1.76※※＃＃5.41±2.015.40±2.24 5.69±1.810.243 0.785 Treg細(xì)胞／CD4＋CD25＋CD127high1.30±0.601.07±0.41 0.94±0.34※※5.644 0.005

2.3 各組外周血hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：ACS組hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)均明顯高于正常對照組和SAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SAP組中PWBC計(jì)數(shù)與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），hs-CRP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組外周血hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)的比較（±s）

表3 各組外周血hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)的比較（±s）

與正常對照組比較：※※P＜0.01；與SAP組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

項(xiàng)目正常對照組（n＝24）SAP組（n＝24）ACS組（n＝48）F值P值hs-CRP（mg／L）2.82±2.863.14±3.047.36±1.77※※＃＃39.140 0.000 PWBC（×109／L）5.54±1.126.86±0.77※※7.65±1.63※※＃19.696 0.000

2.4 CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例與hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)的相關(guān)性對上述3項(xiàng)指標(biāo)采用Pearson直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例和hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），見表4。hs-CRP和PWBC計(jì)數(shù)具有正相關(guān)性（r＝0.296，P＝0.03）。

表4 CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例與hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

ACS是由于冠狀動(dòng)脈內(nèi)不穩(wěn)定的斑塊破潰和斑塊內(nèi)出血，繼發(fā)血栓形成，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔堵塞的一組臨床綜合征，其病程包括炎性反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)［3］。Treg細(xì)胞是一組具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞為其中數(shù)量少而作用重要的一群T淋巴細(xì)胞，具有免疫抑制性和免疫無能性，通過細(xì)胞間接觸和分泌具有抑制作用的細(xì)胞因子來發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［4］。CD127是IL-7受體α鏈，在T淋巴細(xì)胞的增殖、分化和成熟中起重要作用，CD127在Treg細(xì)胞中低表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用CD25高表達(dá)和CD127低表達(dá)，能夠有效去除CD25＋T淋巴細(xì)胞中效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而準(zhǔn)確反映Treg細(xì)胞的數(shù)量［5］。

研究［6－7］顯示通過輸注或誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞可延緩AS的發(fā)展、抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，表明Treg細(xì)胞在AS及ACS的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。Sardella et al［8］研究發(fā)現(xiàn)ACS患者的CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量減少，并且其抑制CD4＋CD25－效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖的能力減弱。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測ACS組、SAP組及正常對照組外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞表達(dá)水平，結(jié)果顯示ACS組外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例顯著低于SAP組和正常對照組，推測可能由于CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞的數(shù)量減少減弱了對機(jī)體炎癥反應(yīng)的抑制作用，機(jī)體更易于發(fā)生炎癥免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致炎癥激活、斑塊不穩(wěn)定及ACS的發(fā)生。因此，對CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞的檢測有可能作為衡量動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定的指標(biāo)之一。此外，SAP組的Treg細(xì)胞表達(dá)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能由于SAP患者體內(nèi)多是穩(wěn)定性斑塊，并且局部炎癥反應(yīng)較輕。

CD4＋效應(yīng)性T細(xì)胞活化后高表達(dá)CD127 （CD127high），而真正的Treg細(xì)胞低表達(dá)CD127 （CD127low），因此CD127high可作為機(jī)體活化效應(yīng)性T細(xì)胞的表面標(biāo)志物［9］。王劍等［10］研究發(fā)現(xiàn)CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞具有抑制效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增殖的能力，而且隨著CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞的減少，CD4＋CD25＋CD127highT淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)逐步升高?；赥reg細(xì)胞與效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的相互抑制作用，控制Treg細(xì)胞／CD4＋CD25＋CD127high的比值、提高效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞對Treg細(xì)胞的抑制作用可能為ACS患者提供一種新的免疫治療方案［11］。

CRP是人體非特異性炎癥反應(yīng)最敏感的標(biāo)志物之一，目前hs-CRP在AS發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益明顯，hs-CRP可以作為炎性指標(biāo)中預(yù)測冠心病事件的獨(dú)立因子［12］。本研究結(jié)果顯示，正常對照組、SAP組及ACS組hs-CRP水平呈上升趨勢，其中在ACS組升高顯著，表明體內(nèi)可能存在內(nèi)環(huán)境紊亂、炎性反應(yīng)增加、免疫活動(dòng)過強(qiáng)等情況。

Hillis et al［13］研究發(fā)現(xiàn)PWBC計(jì)數(shù)水平在冠心病患者中明顯升高，而且病變嚴(yán)重時(shí)和急性期更加明顯，同時(shí)發(fā)生PWBC計(jì)數(shù)水平與ACS患者住院不良事件的發(fā)生呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ACS組的PWBC水平較SAP組和正常對照組顯著升高，SAP組PWBC水平較正常對照組也明顯升高。同時(shí)CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋細(xì)胞比例與hs-CRP、PWBC計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析顯示其存在負(fù)性相關(guān)，表明冠心病患者體內(nèi)炎性反應(yīng)高度激活，免疫活動(dòng)過強(qiáng)與體內(nèi)CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞降低存在一定聯(lián)系，但其具體機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，CD4＋CD25＋CD127lowTreg細(xì)胞在AS 和ACS的發(fā)生、發(fā)展中扮演了很重要的角色，但由于本研究的樣本量較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的局限性。今后通過更大樣本、更完善的臨床試驗(yàn)深入研究Treg細(xì)胞在AS及ACS中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于尋找免疫治療新策略。

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The change and clinical significance of circulating CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells in patients with acute coronary syndrome

Xu Linjie，Wu Jixiong，Xu Banglong，et al
（Dept of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the change of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T（Treg）cells in peripheral blood of patients with acute coronary syndrome（ACS）and explore its clinical significance.Methods96 subjects were divided into three groups：ACS（n＝48），stable angina pectoris（SAP，n＝24）and normal patients（n＝24）.CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells were detected by flow cytometry，and the levels of high-sensitivitiy C-reactive protein（hs-CRP），peripheral white blood cells（PWBC）were tested in each group.ResultsThe ratio of CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells in peripheral blood of patients with ACS［（3.18±1.76）%］was significantly lower than that of normal patients［（5.64±1.63）%］and patients with SAP［（5.60±1.56）%］（F＝25.247，P＜0.01）.The levels of hs-CRP，PWBC in patients with ACS were higher than that of normal patients and patients with SAP（P＜0.05）.Besides，the level of CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells was negatively correlated with hs-CRP and PWBC（r＝－0.518，－0.311 respectively；P＜0.01）.ConclusionIn ACS patients，the decreased Treg cells may participate in the development of atherosclerosis through break the balance of peripheral immune-tolerance and activate the inflammatory response.

acute coronary syndrome；regulatory T cells；high-sensitivitiy C-reactive protein；white blood cell；flow cytometry

R 541.4；R 392.12；R 341

1000－1492（2014）05－0637－04

2013－11－25接收

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230601

徐林杰，女，碩士研究生；

吳繼雄，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：WJX8261＠163.com