陳曉菲，許文華，任明山

急性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細胞表達及其臨床意義

陳曉菲，許文華，任明山

目的動態(tài)觀察急性腦梗死患者不同時期外周血單個核細胞（PBMC）中CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）表達，探討其對急性缺血性腦卒中免疫狀態(tài)及病程進展的影響。方法選取急性腦梗死患者60例為腦卒中組，并分為發(fā)病24～48 h組（n＝16）、3～7 d組（n＝22）和8～14 d組（n＝22）；另選取健康體檢者22例為對照組。采用流式細胞術(shù)檢測60例急性腦梗死患者和22例健康體檢者外周血中CD4＋CD25＋CD127lowTreg水平并進行分析。結(jié)果與對照組比較，腦卒中組外周血CD4＋CD25＋CD127low、CD4＋CD25highTreg比例在起病后24～48 h、3～7 d時顯著降低（P＜0.01）；8～14 d逐漸恢復(fù)至正常水平，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組比較，腦卒中組的CD4＋T細胞比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論Treg可能參與急性缺血性腦卒中的病理生理過程，其功能失衡在急性缺血性腦卒中炎性損傷中具有重要作用，早期檢測可能為其治療提供依據(jù)。

腦缺血；卒中；CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞；CD127；流式細胞術(shù)

調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）是具有免疫無反應(yīng)和免疫抑制兩大功能特征的具有免疫調(diào)節(jié)活性的T細胞亞群，其在免疫穩(wěn)態(tài)、移植反應(yīng)、過敏反應(yīng)、腫瘤免疫和微生物感染等方面均具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3特別表達于CD4＋CD25＋Treg，是其特異性標志物。但由于Foxp3是一種細胞核內(nèi)成分，檢測時需要固定破膜，并不能用于分離人類Treg細胞以作功能性研究，因此限制了其在人類中的應(yīng)用［1］。最近的研究［2－3］表明，CD4＋CD25highCD127lowT細胞是目前人類外周血中自然發(fā)生的Treg細胞最好的膜標志物。低表達的IL-7Rα鏈（CD127）與高表達的IL-2受體的α鏈（CD25）結(jié)合能夠更好地分離和鑒定具有高抑制功能的純化Treg亞群［4－5］。因此，采用CD25high和CD127low這對標志物進行臨床研究將能夠更精確地描述急性腦梗死患者Treg的調(diào)節(jié)功能。該研究通過動態(tài)檢測急性腦梗死患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中CD4＋CD25＋CD127lowTreg的表達，從而進一步揭示急性缺血性腦卒中的免疫相關(guān)發(fā)病機制，為發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2013年1月～5月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死患者60例，作為腦卒中組，其中男41例，女19例，年齡43 ～80（61.50±10.69）歲。其中發(fā)病24～48 h組16例，3～7 d組22例，8～14 d組22例。疾病診斷符合第四屆全國腦血管病會議修訂標準，全部病例均經(jīng)頭部CT和（或）MRI證實。其中包括各種不同部位的腦梗死病例。所有患者均為24 h內(nèi)的初次發(fā)病患者，且無心、肝、腎疾病及糖尿病，無自身免疫性疾病，排除顱內(nèi)其他病變，近期無其他感染性疾病。另設(shè)對照組22例，其中男15例，女7例，年齡44～80（59.63±9.81）歲，均系無心、肝、腦、腎和免疫、感染性疾病及糖尿病的健康成年人，頭部MRI檢查無顱內(nèi)疾病。腦卒中組與對照組在年齡和性別上均匹配，具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD4單抗（克隆號13B8.2）、藻紅蛋白（PE）標記的CD25單抗（克隆號U7.27）和CD25同型陰性對照試劑購自美國Beckman-Coulter公司；PE標記的CD127單抗（克隆號hiL-7R-M21）購自美國eBioscience公司；溶血劑為0.83%的氯化銨溶液，由本院中心實驗室用去離子蒸餾水自行配制。流式細胞儀購自美國BD公司（型號BD FACSCalibur），熒光激發(fā)波長為488 nm和635 nm，分析軟件為CellQuest Pro系統(tǒng)。

1.3 流式細胞儀檢測受試者均于清晨空腹狀態(tài)下抽取肘靜脈血2～3 ml，肝素抗凝，標本在采集后2 h內(nèi)測定。檢測時取抗凝全血100 μl，加入CD25-PE、CD4-FITC各10 μl及CD127-PE 2.5 μl，震蕩器上充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入溶血劑2 ml，充分震蕩混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，加入生理鹽水2 ml，1 500 r／min離心5 min棄上清液，取500 μl立即上流式細胞儀檢測。每次檢測前常規(guī)用熒光微球和同型陰性對照試劑對儀器進行質(zhì)量監(jiān)測和調(diào)控，并用標準方法對各熒光素之間的干擾進行補償，排除相互干擾。檢測時先根據(jù)前向角和側(cè)向角散射光信號，對淋巴細胞群進行設(shè)門，每次獲取設(shè)門內(nèi)細胞20 000個以上并保存數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組樣本間采用單因素方差分析進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 急性腦梗死患者和健康體檢者外周血CD4＋CD25＋CD127lowT細胞、CD4＋CD25highT細胞水平比較結(jié)果顯示，與對照組比較，腦卒中組外周血CD4＋CD25＋CD127lowT細胞、CD4＋CD25highT細胞占CD4＋T細胞比例在起病后24～48 h、3～7 d時顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；8～14 d則逐漸恢復(fù)至正常水平，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1，圖1、2。

2.2 急性腦梗死患者和健康體檢者外周血CD4＋T細胞水平比較結(jié)果顯示，與對照組比較，腦卒中組外周血CD4＋T細胞占淋巴細胞比例在起病后24 ～48 h、3～7 d、8～14 d時均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組中CD4＋CD25high、CD4＋CD25＋CD127low、CD4＋T細胞的檢測結(jié)果（%，±s）

表1 不同組中CD4＋CD25high、CD4＋CD25＋CD127low、CD4＋T細胞的檢測結(jié)果（%，±s）

與對照組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01

組別nCD4＋CD25high／CD4＋CD4＋／CD4＋CD25＋CD127low／CD4＋淋巴細胞腦卒中24～48 h160.67±0.33△△4.56±0.96△△35.24±7.74△3～7 d220.77±0.31△△4.51±0.64△△37.72±11.53△8～14 d220.95±0.235.25±1.3036.96±11.29△對照220.96±0.145.35±0.5527.58±7.03

圖1 各組外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg表達

圖2 各組外周血CD4＋CD25highTreg表達

3 討論

近來研究［6］顯示，腦卒中的病理過程正如炎癥性腸病、繼發(fā)性血管炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或抗磷脂綜合征等一樣，也是一個復(fù)雜的全身炎癥性疾病或自身免疫過程。該研究表明炎性免疫反應(yīng)可能在急性缺血性腦損傷中具有重要作用，卒中后的免疫抑制成為當今治療急性缺血性腦損傷的重要靶點。

CD4＋CD25＋Treg是指部分高表達IL-2受體的α鏈（CD25）分子的CD4＋T細胞［7］，是一類具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，能夠通過免疫負性調(diào)節(jié)的方式來抑制自身反應(yīng)性T細胞的效應(yīng)，負向調(diào)節(jié)機體的免疫炎癥反應(yīng)，維持免疫耐受。Foxp3是其特異性細胞標志物，但人Treg不同于小鼠，其表型非常復(fù)雜。最近的研究［8－10］結(jié)果顯示，在4個潛在的Treg種群中，人外周血CD4＋CD25＋CD127lowT細胞的Foxp3更容易表達，其中CD25highCD127low／－T細胞包含最多的Foxp3，并且表明在分離的CD4＋CD25＋CD127low／－T細胞中有95%表達Foxp3，不表達Foxp3的是CD4＋CD25－T細胞。這表明CD4＋CD25＋CD127low／－T細胞是目前發(fā)現(xiàn)的最能表達高水平Foxp3的標志物，更適用于人類外周血中Treg的功能性研究。

Liesz et al［11］首次提出CD4＋CD25＋Treg在急性缺血性卒中方面起到關(guān)鍵作用，并指出其可抑制急性缺血后促炎因子表達的上調(diào)及阻止中性粒細胞、淋巴細胞與小膠質(zhì)細胞的活化和向大腦的入侵，從而減輕腦組織免疫炎性損傷的發(fā)生。本臨床實驗結(jié)果顯示，急性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋CD127low／－T細胞和CD4＋CD25highT細胞比例在24 ～48 h及1～3 d時均較健康體檢者下降，以后逐漸上升，至8～14 d時與健康體檢者已無明顯差異。該研究表明在急性腦梗死后早期階段，炎性免疫反應(yīng)以促炎反應(yīng)為主，促炎因子過度激活，效應(yīng)T細胞過度活化，使Treg相對性減少，抑制了Treg活化分化，正是由于Treg免疫抑制能力的下降，這些發(fā)揮免疫保護作用的Treg數(shù)量和功能的抑制加重了炎性反應(yīng)所致的腦組織二次損傷。提示CD4＋CD25＋CD127low／－T細胞對缺血性腦損傷具有保護作用，其功能下調(diào)導(dǎo)致了缺血性腦損傷進一步加重。

目前，CD4＋CD25＋Treg表達水平在缺血性腦卒中方面的研究僅見動物實驗報道。楊雙文等［12］研究發(fā)現(xiàn)，實驗小鼠短暫性腦缺血后，脾臟單個核細胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋T細胞在缺血再灌注24 h時比例較對照組明顯減少，但在72 h時基本恢復(fù)正常，5 d時則明顯高于對照組，且這些變化與腦梗死容積變化密切相關(guān)。陳瑞清等［13］研究發(fā)現(xiàn)，外周血中CD4＋CD25＋Treg在大鼠腦缺血后1、3 d時表達與對照組無明顯差異，而到7 d時表達高于對照組，以后逐漸上升，到14 d時則明顯高于對照組。這些實驗研究結(jié)果提示CD4＋CD25＋Treg與腦梗死發(fā)病后的病理變化具有明確的因果關(guān)系，其基本的變化趨勢為CD4＋CD25＋Treg表達水平在腦梗死發(fā)病后早起即降低，后期逐漸升高。但在后期升高的時間點和升高的水平方面存在爭議，這可能與選取的實驗對象分別是人和動物有關(guān)、以及表面標記物的選擇及檢測手段方法不同有關(guān)。

新的免疫學(xué)理論認為，CD4＋T細胞在不同的理化因素作用下可分化成如輔助性T細胞1（Th1）、輔助性T細胞2（Th2）、Treg和輔助性T細胞17 （Th17）等不同功能的細胞亞群。本研究結(jié)果顯示，與健康體檢者相比，急性腦梗死患者的CD4＋T細胞比例明顯增高?？赡苡捎谧渲泻髶p傷所導(dǎo)致的血腦屏障破壞，使得平時隱含的特殊的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原暴露于免疫系統(tǒng)并得以進入體循環(huán)，從而可能造成自身免疫性損傷。與此同時，急性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋CD127low／－T細胞和CD4＋CD25highT細胞比例在發(fā)病24～48 h及3～7 d較健康體檢者下降，該研究表明在急性腦梗死急性期免疫炎性反應(yīng)被激活，CD4＋T細胞可能以誘導(dǎo)分化成促炎細胞因子為主，而具有免疫抑制功能的Treg數(shù)量和功能則受到抑制，從而加重了腦組織損傷。而患者外周血CD4＋CD25＋CD127low／－T細胞和CD4＋CD25highT細胞比例在發(fā)病8～14 d逐漸恢復(fù)至正常水平，則可能在缺血性腦卒中恢復(fù)期，機體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的Treg，從而抑制免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生，促進腦組織神經(jīng)元的修復(fù)。

總之，急性腦梗死患者急性期存在免疫耐受缺陷，Treg功能失衡是急性缺血性腦卒中免疫功能紊亂的重要因素，CD4＋CD25＋CD127lowTreg作為一種具有免疫炎癥負性調(diào)節(jié)作用的T細胞亞群，對缺血性腦卒中后腦組織具有保護作用，本結(jié)果為進一步闡明急性缺血性腦卒中的免疫機制提供了新證據(jù)，為卒中后免疫抑制治療提供理論基礎(chǔ)。

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Clinical significance of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells expression in the peripheral blood of patients with acute cerebral infarction

Chen Xiaofei，Xu Wenhua，Ren Mingshan
（Dept of Neurology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the expression of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells（PBMNCs）in order to explore the influence on the immune status and disease progression in the different period of acute ischemic stroke.Methods60 patients with acute cerebral infarction were selected as the stroke group，and divided them into the 24～48 h group（n＝16），3～7 d group（n＝22）and 8～14 d group（n ＝22）；22 healthy human were set as the control group.To analyze the percentage of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells in the peripheral blood of acute cerebral infarction patients and healthy human with flow cytometry.ResultsThe percentages of CD4＋CD25＋CD127lowand CD4＋CD25highregulatory T cells in the peripheral blood of the stroke group were significantly decreased at 24～48 h，3～7 d（P＜0.01）when compared with the control group，and then tended to return toward the control value at 8～14 d（P＞0.05）；the percentage of CD4＋regulatory T cells in the peripheral blood of the stroke group was significantly higher than control group（P＜0.05）.ConclusionImbalance of regulatory T cells is very likely to play an important role in the immunological injury of acute ischemic stroke.Regulatory T cells may be involved in the pathogenesis of acute ischemic stroke，and early detection may provide a basis for treatment.

cerebral ischemia；stroke；CD4＋CD25＋regulatory T cells；CD127；flow cytometry

R 743.3

1000－1492（2014）05－0633－04

2013－11－15接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81000550）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，合肥 230001

陳曉菲，女，碩士研究生；

任明山，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：renmingshan 2012＠163.com