顧俊菲，葉山東，汪 姍，孫文佳，胡圓圓

二甲雙胍對大鼠腎小球系膜細胞NF-κB、MCP-1、ICAM-1表達及合成的影響

顧俊菲，葉山東，汪 姍，孫文佳，胡圓圓

目的觀察二甲雙胍對大鼠腎小球系膜細胞（MCs）核因子-κB（NF-κB）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達及合成的影響，探討其對腎臟的保護機制。方法體外培養(yǎng)MCs，隨機分為正常糖組（NG）、高糖組（HG）及高糖＋不同濃度二甲雙胍組（M1、M2、M3）。培養(yǎng)48 h后收集各組細胞及上清液，采用熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time PCR）法檢測細胞NF-κB、MCP-1及ICAM-1的mRNA含量；采用Western blot法檢測細胞NF-κBp65及ICAM-1蛋白表達水平；采用ELISA法檢測上清液中MCP-1蛋白濃度。結(jié)果①MCs可表達NF-κB、MCP-1 和ICAM-1；②與NG組比較，HG組MCs NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA表達增強，NF-κBp65、ICAM-1及細胞上清液中MCP-1蛋白含量增高（P＜0.05）；③經(jīng)二甲雙胍干預(yù)后，高糖培養(yǎng)的MCs NF-κB、MCP-1及ICAM-1表達合成顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論二甲雙胍可抑制MCs NF-κB、MCP-1和ICAM-1的表達及合成，該作用可能與其腎臟保護機制有關(guān)。

二甲雙胍；核因子-κB；單核細胞趨化蛋白-1；細胞間黏附分子-1

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）作為糖尿病微血管并發(fā)癥，已成為導(dǎo)致終末期腎衰竭最常見的病因，其發(fā)病機制尚未明確，涉及代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腎小球血流動力學(xué)改變和遺傳易感性等。系膜細胞在維持腎小球的結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要的作用，并且參與了多種腎小球疾病的致病過程。二甲雙胍作為一線抗糖尿病藥物，可能通過多種途徑對糖尿病腎臟病變有著獨立于降糖作用之外的積極影響，部分機制可能與其抑制腎臟局部炎癥因子有關(guān)。該實驗通過在體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞（mesangial cells，MCs），觀察高糖及二甲雙胍對MCs炎癥因子核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）水平的影響，探討其對腎臟的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 MCs購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要藥物與試劑 二甲雙胍、預(yù)染Marker（美國Sigma公司）；低糖DMEM培養(yǎng)液、高糖DMEM培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州市四季青公司）；胰蛋白酶（美國GIBCO-BRL公司）；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；Real-time PCR試劑及所用引物（大連TaKaRa公司）；ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒和ECL檢測液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗NF-κBp65多克隆抗體、兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；β-actin抗體（上海生工生物工程有限公司）；辣根酶標記羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

1.2.1 系膜細胞培養(yǎng) MCs常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的低糖DMEM（Glu 5.6 mmol／L）培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2孵育箱中孵育，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，取4～6代細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h待細胞達到亞融合狀態(tài)，換用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h，使所有細胞生長同步化，隨后隨機分為5組觀察：①正常對照組（NG組）：DMEM培養(yǎng)液（Glu 5.6 mmol／L）；②高糖組（HG組）：DMEM培養(yǎng)液（Glu 25 mmol／L）；③二甲雙胍組（M組）分3個亞組，M1組：HG＋二甲雙胍（0.5 mmol／L）；M2組：HG＋二甲雙胍（1.0mmol／L）；M3組：HG＋二甲雙胍（2.0 mmol／L）。以上各組標本培養(yǎng)48 h后收集細胞及上清液。每組實驗細胞培養(yǎng)重復(fù)6次。

1.3 Real-time PCR測定MCs中NF-κB、ICAM-1、MCP-1的mRNA表達TRIzol法提取細胞RNA，測定A260／A280值在1.8～2.0，紫外分光光度計測定濃度后，取2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物分別進行NF-κB、MCP-1及β-actin的擴增。NF-κB上游引物序列：5′-GGCA CAGT CAAG GCTG AGAA TG-3′，下游：5′-ATG G TGGT GAAG ACGA CGCC AGTA-3′；MCP-1上游引物序列：5′-CAAG GTAA GGAG CATAGAGCCAAC-3′，下游：5′-GAGG AAAT AGGG GAGCA GGAA C-3′；ICAM-1上游引物序列：5′-GCCC GGAG GATC ACAA ACGA C-3′，下游：5′-CCTG GGGC TGGC ATGT AAGA GT-3′；β-actin上游引物序列：5′-GCCT TAGC CTGG ACCC ATAG T-3′，下游：5′-GACC ACCA ATCC ACAC AGA-3′。使用ABI7500型擴增儀，20 μl反應(yīng)體系熒光染料法，95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸1 min的熱循環(huán)40次；95℃15 s、60℃1 min及95℃15 s循環(huán)1次。內(nèi)參和目的片段分別同批擴增，每組設(shè)置3個復(fù)孔，采用ΔΔCt法分析Ct值，2－ΔΔCt表示目的基因mRNA表達的拷貝數(shù)與β-actin拷貝數(shù)之比。

1.4 Western blot法測定MCs中NF-κBp65和ICAM-1水平使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白提取液加入上樣緩沖液，95℃水煮5 min，使蛋白變性。分別等量點樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），脫脂奶粉封閉，將一抗NF-κBp65（1∶1 000）、ICAM-1（1∶1 000）、β-actin （1∶1 000）置于4℃過夜，洗膜，二抗（1∶5 000）孵育，ECL化學(xué)發(fā)光，X線片顯影定影。底片用Quatity One軟件進行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值表示目的蛋白表達的相對含量。

1.5 MCs上清液中的MCP-1蛋白含量測定采用雙抗體夾心法檢測MCP-1蛋白含量，具體步驟按照試劑盒說明進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示。方差齊性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間比較，采用SNK檢驗進行兩兩比較；方差不齊性數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）進行組間比較，采用Mann-Whitney U檢驗進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對高糖刺激下MCs NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA表達的影響與NG組比較，HG 組NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05），M1、M2和M3組相對表達量逐漸降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。與HG組比較，M1、M2和M3組NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA相對表達量皆顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Real-time PCR測定各組NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA表達

2.2 二甲雙胍對高糖刺激下MCs上清液中MCP-1蛋白合成的影響與NG組比較，HG組、M1組、M2組MCP-1水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；M3組MCP-1水平輕度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與HG組比較，M1、M2和M3組上清液MCP-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 二甲雙胍對高糖刺激下系膜細胞NF-κBp65、ICAM-1蛋白合成的影響與NG組比較，HG、M1、M2、M3組NF-κBp65、ICAM-1蛋白相對表達量皆顯著升高（P＜0.01），其中M1、M2和M3組呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。與HG組比較，其余各組NF-κBp65、ICAM-1蛋白相對表達量皆明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

3 討論

圖2 ELISA法測定各組上清液MCP-1蛋白水平

圖3 Western blot法測定各組NF-κBp65、ICAM-1蛋白水平

MCs是腎臟的固有細胞之一，在維持腎小球生理功能中發(fā)揮重要作用。當炎癥等病理狀態(tài)時，MCs被激活增殖，細胞外基質(zhì)合成和降解失衡，使細胞外基質(zhì)堆積，通過自分泌或旁分泌擴大細胞因子效應(yīng)，損傷的腎小球可發(fā)展為腎小球硬化［1］。DN 以MCs病變?yōu)樘卣?，突出表現(xiàn)為MCs增生肥大，細胞外基質(zhì)堆積。目前研究［2］顯示，其發(fā)病機制與高糖所致的糖基化、多元醇通路激活、蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)，其中炎癥狀態(tài)貫穿DN始終。DN患者和動物DN模型皆發(fā)現(xiàn)腎臟存在巨噬細胞浸潤、炎癥因子和黏附分子活化。

NF-κB在核蛋白家族中，主要發(fā)揮生理作用的是p50／p65二聚體，在組織細胞中廣泛存在，調(diào)節(jié)多種細胞因子、炎癥介質(zhì)、趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄。Schmid et al［3］通過人腎臟活檢發(fā)現(xiàn)NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路在糖尿病腎組織顯著上調(diào)。Tesch［4］發(fā)現(xiàn)高糖刺激下MCs高表達NF-κB，可促進MCP-1合成。MCP-1在大鼠DN模型中表達增加，可介導(dǎo)單核巨噬細胞遷移，上調(diào)黏附分子和其他細胞因子表達。在MCP-1缺陷型1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿?。═2DM）動物模型中，腎臟損傷程度皆有所降低。ICAM-1作為細胞表面糖蛋白，介導(dǎo)白細胞向內(nèi)皮細胞黏附，生理狀況下，系膜細胞僅少量表達。在高糖、高脂血癥、高胰島素血癥或前炎癥因子等的誘導(dǎo)下，ICAM-1可大量合成。有研究［5］表明，高糖可以通過PKC-NF-κB依賴途徑誘導(dǎo)大鼠MCs ICAM-1等細胞因子的表達，參與DN的發(fā)生。臨床研究［6］中T2DM患者體內(nèi)可溶型ICAM-1增加。Okada et al［7］將基因敲除的ICAM-1（－／－）鏈脲霉素（STZ）模型鼠較之ICAM-1（＋／＋）鼠，血肌酐、尿素氮大大降低，白蛋白尿減少、腎小球肥大及系膜基質(zhì)沉積減輕，同時腎小球中轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、Ⅳ型膠原的表達受抑制，認為ICAM-1及其誘導(dǎo)浸潤的巨噬細胞在DN的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。Giunti et al［8］研究認為高糖通過活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）激活NF-κB，進而上調(diào)MCP-1的表達，介導(dǎo)了系膜細胞的炎癥反應(yīng)。過度表達的MCP-1能夠激活單核細胞中的溶酶體酶及蛋白水解酶，促進ROS釋放，引發(fā)氧化應(yīng)激，從而促進DN發(fā)生；MCP-1也可促進ICAM-1等多種細胞因子合成和釋放，加劇單核巨噬細胞在腎組織浸潤及TGF-β1和結(jié)締組織生長因子等生成，促進細胞外基質(zhì)合成和分泌，參與腎小球纖維化。本實驗結(jié)果顯示MCs可低度表達NF-κB、MCP-1和ICAM-1，高糖作用下細胞NF-κB、MCP-1 和ICAM-1表達明顯增加，其機制可能與高糖通過PKC、ROS或糖基化終末產(chǎn)物途徑激活NF-κB，上調(diào)MCP-1和ICAM-1表達有關(guān)。

二甲雙胍作為經(jīng)典降糖藥，近年來研究［9］顯示其具有抗炎、減輕氧化應(yīng)激、抑制糖基化和脂質(zhì)沉積等部分獨立于降糖之外的作用。臨床研究［10］表明二甲雙胍可降低DN患者血清高敏C反應(yīng)蛋白、MCP-1和ICAM-1水平，減少尿蛋白和尿MCP-1排泄。對DM大鼠給予500 mg／kg二甲雙胍8周后，可見細胞外基質(zhì)堆積和腎小球基底膜增厚明顯改善［11］。本研究在體外證明二甲雙胍可抑制MCs NF-κB、MCP-1及ICAM-1的表達，并具有一定的濃度依賴性，可能通過抗炎延緩DN進展。二甲雙胍直接作用于線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體，通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），下調(diào)NF-κB及下游炎癥因子表達［9］。二甲雙胍可獨立于AMPK，直接抑制IκB磷酸化，使NF-κB、MCP-1和ICAM-1合成減少。此外，二甲雙胍可通過抑制ROS等的生成，下調(diào)炎癥反應(yīng)，延緩纖維化進程。

總之，本研究結(jié)果初步提示二甲雙胍可降低高糖誘導(dǎo)的MCs NF-κB、MCP-1和ICAM-1表達，該作用可能與腎臟保護有關(guān)，確切機制尚需進一步研究。

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Effects of metformin on expression and synthesis of intercellular adhesion molecule-1，monocyte chemoattractant protein-1 and nuclear factor-κB in rat glomerular mesangial cells

Gu Junfei，Ye Shandong，Wang Shan，et al
（Dept of Endocrinology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo observe the effects of metformin on expression and synthesis of nuclear factor-κB（NF-κB），monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）in cultured rat glomerular mesangial cells（MCs）and explore its reno-protective mechanisms.MethodsMCs were cultured in the medium with normal glucose（group NG），high glucose（group HG）and different concentrations of metformin （group M1，M2，M3）.After 48 h exposure，the supernatants and MCs were collected.The expression of NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 mRNA was analyzed by Real-time PCR and MCP-1 protein synthesis by ELISA.NF-κBp65 and ICAM-1 were visualized by Western blot.Results①MCs could express NF-κB，ICAM-1and MCP-1.②After being stimulated by high glucose，the levels of intracelluar NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 were significantly increased compared with group NG（P＜0.05）.③The levels of NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 were significantly decreased in group M1，M2 and group M3 compared with group HG（P＜0.05）.ConclusionMetformin can suppress the expression and synthesis of NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 of glomerular mesangial cells，which may partly contribute to its reno-protection.

metformin；NF-κB；MCP-1；ICAM-1

R 349.51；R 587.24

1000－1492（2014）05－0582－04

2013－12－12接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：11040606M161）；安徽高校省級自然科學(xué)研究項目（編號：KJ2011A157）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230001

顧俊菲，女，碩士研究生；

葉山東，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：ysd196406＠163.com