李 娟，羅以勤，丁邦勝，賀學(xué)姣，周 明，趙 亮，姚麗娟

tumstatin基因修飾的CD34＋造血干細(xì)胞生成抗血管生成活性的血小板

李 娟1，羅以勤1，丁邦勝1，賀學(xué)姣1，周 明2，趙 亮1，姚麗娟1

目的以慢病毒為基因載體，將tumstatin cDNA導(dǎo)入CD34＋造血干細(xì)胞，在體外誘導(dǎo)生成tumstatin基因修飾的巨核細(xì)胞（MKs）和血小板，檢測產(chǎn)生的血小板對血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的作用。方法構(gòu)建pLVX-tumstatin-mCMVZsGreen重組載體后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。用密度梯度離心法結(jié)合免疫磁珠分離法富集臍血中CD34＋造血干細(xì)胞。用慢病毒感染CD34＋造血干細(xì)胞，在細(xì)胞因子組合培養(yǎng)液中誘導(dǎo)MKs生成，流式細(xì)胞儀和形態(tài)學(xué)檢測MKs的生成及產(chǎn)血小板情況。應(yīng)用RT-PCR法和Western blot法檢測tumstatin基因的表達(dá)，通過人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成抑制試驗(yàn)研究血小板內(nèi)容物生物學(xué)活性。結(jié)果選擇最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）30∶1感染干細(xì)胞時(shí)效率最高；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞在誘導(dǎo)過程中，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞都有MKs與血小板的生成，且生長速度和分化趨勢基本相同。在轉(zhuǎn)染的MKs基因組里，RT-PCR法檢測到738 bp tumstatin基因片段。Western blot法檢測到tumstatin在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞來源的血小板中穩(wěn)定表達(dá)，血小板可明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成。結(jié)論基因修飾的CD34＋造血干細(xì)胞在體外成功誘導(dǎo)分化為MKs和血小板并表達(dá)tumstatin蛋白，且這種血小板在體外顯著抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)形成。

tumstatin；慢病毒載體；CD34＋造血干細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；巨核細(xì)胞；血小板

血小板中含有許多血管新生促進(jìn)因子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等以及血管生成抑制因子如凝血酶敏感蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）等，這些因子在血管生成中起到重要的調(diào)節(jié)作用［1］。研究［2］顯示，盡管血管生成抑制因子和促進(jìn)因子均存在于血小板α顆粒內(nèi)，但血小板在影響血管生成過程中，總的趨勢是促進(jìn)血管生成。腫瘤細(xì)胞可釋放血小板活化因子誘導(dǎo)循環(huán)中的血小板活化和聚集，使其釋放顆粒里的內(nèi)容物，為腫瘤血管生成提供了豐富的血管生成促進(jìn)因子，從而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［3］。研究［4］顯示tumstatin是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，大量來源于腎、肺、睪丸基底膜上的Ⅳ膠原α3鏈。tumstatin通過功能性受體特異性地誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤的生長。

該研究以慢病毒為基因載體，將tumstatin cDNA導(dǎo)入CD34＋造血干細(xì)胞，進(jìn)一步在體外誘導(dǎo)其大量生成tumstatin基因修飾的巨核細(xì)胞（megakaryocytes，MKs）和血小板，并檢測產(chǎn)生的血小板對血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的抑制作用?；蛐揎椀腗Ks／血小板過表達(dá)血管生成抑制因子tumstatin，有可能改變血管生成過程中血小板促進(jìn)因子作用持續(xù)地占主導(dǎo)的地位。這種過表達(dá)目的蛋白的MKs／血小板，或可稱之“治療性”MKs／血小板，對腫瘤治療以及化療引起的血小板減低癥治療可能有著重要的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑模板質(zhì)粒tumstatin由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室保存；pLVX-mCMV-ZsGreen載體質(zhì)粒及包裝試劑盒購自深圳百恩維生物科技有限公司；臍血由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院產(chǎn)科提供；人重組TPO、IL-3、IL-6、SCF購自英國Pepro Tech公司；無血清培養(yǎng)液Stem SpanTMSFEM購自加拿大Stem Cell Technologies公司；CD34＋、CD61＋細(xì)胞分選試劑盒購自德國Miltenyi Biotee GmbH公司；抗人CD34和CD41a單抗均購自美國eBioscience公司；兔抗人tumstatin抗體購自英國Abcam公司；人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自上海吉?jiǎng)P公司。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-tumstatin-mCMV-ZsGreen載體的構(gòu)建及慢病毒包 以pMAL-tumstatin質(zhì)粒為模板，用PCR法擴(kuò)增tumstatin，在引物中分別引入SpeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物序列：5′-CTAGACTAGTGCCACCATGCCAGGTTTGAAAGGAAACGTGG AG-3′，下游引物序列：5′-CGCGGATCCTCAGTGTCT TTTCTTCATGCACACCTG-3′，劃線部分為酶切位點(diǎn)。慢病毒載體pLVX-mCMV-ZsGreen及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物tumstatin經(jīng)BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切，純化后的產(chǎn)物在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒，同時(shí)做酶切鑒定并測序。重組表達(dá)質(zhì)粒pLVX-tumstatinmCMV-ZsGreen和空慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行重組慢病毒顆粒包裝，按試劑盒說明書進(jìn)行，收集上清液過濾后－80℃保存。HEK 293細(xì)胞進(jìn)行滴度測定，用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)量，在最高稀梯度10m的孔數(shù)出現(xiàn)N（N＜10）個(gè)帶熒光的細(xì)胞，則病毒滴度為N×10mTU／μl。

1.2.2 CD34＋細(xì)胞的篩選及慢病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）初篩 經(jīng)產(chǎn)道分娩胎兒后，收集臍血于CPDA無菌采血袋內(nèi)，4℃保存。采用密度梯度離心法將臍血按4∶1比例加入羥乙基淀粉沉淀紅細(xì)胞，收集上層血漿，緩慢加至Ficoll-Hypaque分離液上，離心收集白膜層，PBS洗滌2次得到人臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞，按照CD34＋細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒說明書進(jìn)行分選后，將CD34＋細(xì)胞接種于含50 μg／L細(xì)胞因子TPO、IL-3、IL-6、SCF的完全培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，并留取30 μl細(xì)胞液流式測定CD34＋細(xì)胞純度。將預(yù)培養(yǎng)72 h后的5×104個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔板，將制備保存的慢病毒按感染復(fù)數(shù)（MOI）0、1∶1、10∶1、30∶1、50∶1感染細(xì)胞，在8 μg／ml的Polybrene存在下，于30℃、800 r／min離心1 h后，種回至12孔板中，每孔加細(xì)胞因子組合培養(yǎng)液1 ml繼續(xù)培養(yǎng)過夜。12 h后換液，此后每2～3 d換液1次并用倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染情況觀察熒光表達(dá)情況，培養(yǎng)1～2周后計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。以表達(dá)ZsGreen綠色熒光的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)同一視野下轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。根據(jù)以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染效率＝ZsGreen陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。轉(zhuǎn)染效率90%以上的最低MOI值為最適MOI。

1.2.3 誘導(dǎo)MKs和血小板的生成及流式細(xì)胞術(shù)分析和細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析 將細(xì)胞分為3組：無病毒感染組、不含目的基因空病毒感染組和含目的基因病毒感染組，將病毒液按照MOI初篩實(shí)驗(yàn)的最佳MOI值感染CD34＋細(xì)胞。觀察細(xì)胞感染情況后，在上述細(xì)胞因子組合培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化，適當(dāng)傳代換液。在第3、7、14天時(shí)，取相應(yīng)細(xì)胞，PBS離心洗滌后分別加入抗CD34、抗CD41a的單抗及同型對照抗體，避光孵育45 min，PBS離心并重懸到1%多聚甲醛溶液中，進(jìn)行流式分析鑒定MKs。同時(shí)，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，先低速離心去除細(xì)胞和碎片，再高速離心得血小板沉淀后，分別加入同型對照抗體和抗CD41a的抗體，避光孵育45 min，PBS離心后重懸到1%多聚甲醛溶液中，進(jìn)行流式分析血小板。另取細(xì)胞進(jìn)行瑞氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

1.2.4 MKs和血小板tumstatin的檢測 用CD61＋磁珠分離收集上述3組細(xì)胞來源的MKs，用TRIzol裂解細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后用特異性tumstatin引物（同上）進(jìn)行PCR檢測，25 μl總反應(yīng)體系，按95℃2 min，95℃30 s變性，58℃30 s退火，72 ℃1 min延伸，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃反應(yīng)1 min 后4℃停止。將各組PCR產(chǎn)物行凝膠電泳分析產(chǎn)物。同時(shí)收集3組細(xì)胞來源的血小板提取總蛋白，用Brandford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，然后按正極濾紙-PVDF膜-PAGE凝膠-濾紙負(fù)極的順序進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后加入5%的脫脂奶粉封閉。最后將膜置于tumstatin一抗中4℃過夜，再置于辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗液中，搖床上孵育1 h。參考Thermo ECL產(chǎn)品說明書，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色拍照分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因血小板內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成抑制實(shí)驗(yàn) 分別收集2組細(xì)胞來源的血小板1×108／ml，以新分離的正常人血小板為對照，利用液氮反復(fù)凍融3次裂解血小板，釋放蛋白。50 μl稀釋的ECMa-trixTM（CHEMICON）加入96孔培養(yǎng)板，37℃孵育1 h待ECMatrixTM凝固，將150 μl不含抗生素的HUVECs（臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）接種到上述包被ECMatrixTM的培養(yǎng)板中，每孔含細(xì)胞數(shù)量為5×103～1× 104個(gè)，然后加入血小板裂解液。試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在1、2、4、8、12 h時(shí)間點(diǎn)觀察不同處理組之間內(nèi)皮細(xì)胞管狀排列情況、單位面積內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量和完整程度的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定及慢病毒包裝本研究用慢病毒質(zhì)粒含雙啟動(dòng)子，分別促進(jìn)目的蛋白tumstatin和標(biāo)記蛋白ZsGreen表達(dá)（圖1A）。將構(gòu)建抽提好的重組質(zhì)粒用SpeⅠ＋BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)738 bp的目的條帶和載體質(zhì)粒條帶，說明慢病毒載體上連入了tumstatin基因（圖1B）。將重組質(zhì)粒pLVX-tumstatin-mCMVZsGreen與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝。轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞被感染情況（圖1C）。包裝后得到的慢病毒tumstatin液進(jìn)行10倍梯度稀釋后感染HEK 293細(xì)胞，在107稀釋梯度孔發(fā)現(xiàn)超過10個(gè)含熒光細(xì)胞，而108稀釋梯度孔發(fā)現(xiàn)1個(gè)含熒光細(xì)胞，因此慢病毒tumstatin滴度為1.0×108TU／ml。

2.2 CD34＋細(xì)胞純度鑒定及感染MOI值初篩每袋臍血體積為100～120 ml，含單個(gè)核細(xì)胞（0.5～1）×108個(gè)。臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活力良好，死細(xì)胞較少。CD34＋免疫磁珠分選得（0.5～1.5）×106個(gè)CD34＋干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測得CD34＋干細(xì)胞的純度達(dá)到約98.5%。通過MOI初篩實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MOI 30∶1轉(zhuǎn)染CD34＋干細(xì)胞感染率較高且熒光持續(xù)較長，而50∶1的MOI值轉(zhuǎn)染的細(xì)胞雖然熒光出現(xiàn)較早但細(xì)胞死亡較多，MOI 10∶1比1∶1的CD34＋干細(xì)胞感染率高但是較MOI 30∶1仍然較低。因此，慢病毒感染CD34＋干細(xì)胞時(shí)，選擇MOI 30∶1為最佳值進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，見圖2。以表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，熒光顯微鏡分析、計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為90.3%。

圖1 重組慢病毒鑒定圖

圖2 綠色熒光蛋白ZsGreen在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)

圖3 CD34＋誘導(dǎo)分化MKs及血小板

2.3 誘導(dǎo)分化的MKs及血小板檢測流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果：由于CD34主要是干細(xì)胞的標(biāo)志，CD41a是MKs和血小板的特異性抗體，因此可檢測CD34和CD41a分子在第3（轉(zhuǎn)染前）、7、14天的表達(dá)來觀察MKs的分化情況以及MKs產(chǎn)血小板情況。結(jié)果顯示：無病毒感染組、不含目的基因空病毒感染組及含目的基因病毒感染組細(xì)胞在相同的時(shí)間，其細(xì)胞表面CD34和CD41a分子表達(dá)變化趨勢基本相同，說明空病毒感染及含目的基因的病毒感染基本不影響細(xì)胞培養(yǎng)過程中的分化。同時(shí)，對不同天數(shù)細(xì)胞CD34和CD41a分子表達(dá)比較，最初分選得CD34＋細(xì)胞陽性率約為98.5%，經(jīng)3 d培養(yǎng)之后CD34＋細(xì)胞陽性率變化不大，其中37.7%的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD41a分子；隨著時(shí)間的增加，表達(dá)CD34分子細(xì)胞越來越少，第14天時(shí)，CD34＋細(xì)胞不到2%；而CD41a細(xì)胞卻不斷增加，但第14天之后，增加速度緩慢。在進(jìn)行血小板流式分析時(shí)，對培養(yǎng)細(xì)胞上清中的沉淀加CD41a分子標(biāo)記（圖3A、B、C），同時(shí)用全血中分離的血小板設(shè)門，結(jié)果顯示：細(xì)胞培養(yǎng)第7天已有少量血小板分泌，在14 d和21 d時(shí)，血小板有明顯增多（圖3D、E）。瑞氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析表明經(jīng)過14 d的培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的MKs形態(tài)，核多葉，并產(chǎn)有大量的血小板（圖3F、G）。研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因表達(dá)并不影響CD34＋細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨MKs和血小板。

2.4 MKs tumstatin基因表達(dá)、血小板tumstatin蛋白表達(dá)檢測CD61＋磁珠分離培養(yǎng)14 d MKs，RTPCR法檢測結(jié)果表明含目的基因慢病毒感染組有738 bp的特異性擴(kuò)增條帶，而無病毒感染組和不含目的基因空病毒感染組無特異性擴(kuò)增條帶（圖4A）。說明tumstatin基因成功導(dǎo)入CD34＋干細(xì)胞基因組中并隨著細(xì)胞分化為MKs，tumstatin基因也存在于MKs中。Western blot法檢測結(jié)果表明，3組細(xì)胞中來源于無病毒感染組和不含目的基因空病毒感染組血小板裂解物無tumstatin蛋白條帶，含目的基因病毒感染組血小板有tumstatin蛋白條帶（圖4B）。表明通過慢病毒介導(dǎo)，tumstatin基因轉(zhuǎn)入CD34＋細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化在MKs和血小板中得到表達(dá)。

圖4 MKs tumstatin基因表達(dá)、血小板tumstatin蛋白表達(dá)

2.5 基因修飾血小板血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成抑制實(shí)驗(yàn)基因修飾的血小板具有抗新生血管生成的作用，進(jìn)行了內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成抑制試驗(yàn)。當(dāng)HUVECs在基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，它們迅速排列形成中空管狀結(jié)構(gòu)，與正常分離血小板和未轉(zhuǎn)染血小板比較，tumstatin基因修飾的顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成。研究結(jié)果顯示未修飾的血小板血管分支數(shù)（NBP）＝82.12±13.1；tumstatin基因修飾血小板NBP＝38.2±7.8；而正常人分離血小板NBP＝146.7±17.8，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝114.51，P＜0.05）。表明tumstatin基因修飾血小板與正常血小板和未轉(zhuǎn)染血小板不同，能顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而推測在體內(nèi)有可能抑制腫瘤新生血管形成。見圖5。

A：未修飾的血小板內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成 ×10；B：tumstatin基因修飾血小板管狀結(jié)構(gòu)形成 ×10；C：正常血小板內(nèi)皮管狀結(jié)構(gòu)形成 ×10；D：各分枝數(shù)比較；與未修飾的血小板比較：*P＜0.05；與正常人血小板比較：＃P＜0.05

3 討論

血小板被認(rèn)為在止、凝血過程中發(fā)揮主要作用，但近些年研究［5］顯示血小板能夠促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，血小板數(shù)量增多與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性，而降低血小板數(shù)量或者抑制其功能可以明顯抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［6］。生理狀態(tài)下腫瘤微環(huán)境中血小板釋放血管生成調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)血管生成，但其血管生成促進(jìn)因子的作用持續(xù)地占有主導(dǎo)地位［1，7］。本研究通過慢病毒介導(dǎo)基因修飾血小板前體細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)、分化后在MKs和血小板中成功過表達(dá)血管生成物抑制因子tumstatin，與正常人血小板比較，這種血小板內(nèi)容物在體外顯著抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)形成。

tumstatin通過特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的合成來實(shí)現(xiàn)對腫瘤新生血管的抑制作用。tumstatin與αvβ3整合素相互作用，抑制局部粘著斑激酶（FAK）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B （PKB／Akt）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，從而降低了真核起始因子4E的磷酸化，在翻譯的過程中，真核起始因子4E無法與4E結(jié)合蛋白1分離，導(dǎo)致帽子依賴型蛋白的合成受到抑制。tumstatin抗血管活性至少是血管抑素endostatin的10倍［8］。因此，考慮用tumstatin作為基因修飾血小板的抗血管生成因子。

該研究慢病毒啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子，可啟動(dòng)基因在多種細(xì)胞表達(dá)，無選擇性，轉(zhuǎn)染的CD34＋細(xì)胞可向不同細(xì)胞系分化。因此，tumstatin除了在MKs和血小板中表達(dá)外，還會(huì)在紅細(xì)胞系和粒細(xì)胞系表達(dá)。為了讓基因只在MKs和血小板中表達(dá)，可選擇MKs／血小板特異性啟動(dòng)子如GpIba［9］。另外，可通過優(yōu)化培養(yǎng)液的細(xì)胞因子組合，引導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞主要分化為MKs和血小板。MKs定義為CD41a＋、CD61＋細(xì)胞，因此可用CD61磁珠分離獲得向MKs／血小板分化的較為單一的細(xì)胞。這種方法可除去其他細(xì)胞及碎片，有利于MKs和血小板的產(chǎn)生。

隨著CD34＋在體外增殖分化為MKs和血小板技術(shù)日趨成熟，為基因修飾血小板研究血小板相關(guān)蛋白功能和治療遺傳性血液病如血友病、巨血小板綜合征提供了可能［8］。血小板可與腫瘤細(xì)胞形成聚集，黏附于血管內(nèi)皮，腫瘤細(xì)胞可激活血小板釋放血小板內(nèi)容物［10］，因此，通過慢病毒介導(dǎo)在血小板中過表達(dá)血管生成抑制因子tumstatin，產(chǎn)生“治療性”血小板，在腫瘤治療中可能具有一定潛力。如腫瘤化療時(shí)可輸注“治療性”血小板，有可能解決化療藥物引起的血小板減少癥、輸注常規(guī)血小板引起的促進(jìn)腫瘤新血管生長的問題；并有可能使抗血管生成基因治療聯(lián)合化療發(fā)揮更大的抗腫瘤效果，這些推測有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Tumstatin gene-modified CD34＋hematopoietic stem cells produce anti-angiogenic platelets

Li Juan，Luo Yiqin，Ding Bangsheng，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveCD34＋hematopoietic stem cells transfected with recombinant lentivirus vector carrying tumstatin cDNA were in vitro induced to produce megakaryocytes（MKs）and platelets.The inhibitory effect of the platelets on the growth of capillary tube structures of HUVEC were detected.MethodsConstructed pLVX-tumstatin-mCMV-ZsGreen recombinant vector was transfected into 293T cells for virus packaging.Cord blood CD34＋hematopoietic stem cells enriched by immunomagnetic separation were transfected with recombinant lentivirus and induced to produce megakaryocytes in the culture medium combinations of cytokines.Flow cytometry and morphological observation were used to detect the generation of megakaryocytes and platelets.RT-PCR and Western blot analysis were applied to examine the expression of tumstatin.Capillary tube structures assay of HUVEC was used to evaluate the inhibitory effect of the platelets in vitro.ResultsCD34＋hematopoietic stem cells transfected with recombinant lentivirus at the best multiplicity of infection（MOI）being 30∶1，ZsGreen positive rate of which was highest.The transfected and untransfected cells generated megakaryocyte and platelets，the growth rate and differentiation trend of which were substantially identical by flow cytometry analysis.RT-PCR detected a 738 bp tumstatin cDNA in transfected MKs.Western blot confirmed the expression of tumstatin protein in gene-modified megakaryocyte and platelets.Tumstatin gene-modified platelets inhibited the capillary tube structures of HUVEC.ConclusionGene-modified CD34＋hematopoietic stem cells not only successfully differentiate into megakaryocyte and platelets but also express tumstatin protein，and this transgenic platelets significantly inhibit the capillary tube structures of HUVEC in vitro.

tumstatin；lentivirus vector；CD34＋hematopoietic stem cell；HUVEC；megakaryocyte；platelet

R 349.63；R 331.2

1000－1492（2014）05－0576－06

2013－12－10接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：11040606M208）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2011A163）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1檢驗(yàn)科、2輸血科，合肥230001

李 娟，女，碩士研究生；

羅以勤，男，副教授，主任技師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：luoyiqin2003＠163.com