司小毛，仇 鵬，朱化剛，余康敏，查斌山，謝文濤，李 俊

缺血預(yù)處理對大鼠肢體缺血再灌注損傷保護(hù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

司小毛1，2，仇 鵬1，朱化剛1，余康敏1，查斌山1，謝文濤1，李 俊1

目的探討缺血預(yù)處理不同時間方案對肢體缺血再灌注損傷保護(hù)作用的差異性，選擇合理的缺血預(yù)處理時間。方法40只SPF級SD大鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組（A組，僅行開腹，分離腹主動脈不阻斷）；缺血再灌注組（B組，夾閉腹主動脈缺血2 h后再灌注2 h）；C、D、E組：分別阻斷腹主動脈1、5和10 min，再灌注1、5和10 min，重復(fù)3個循環(huán)后進(jìn)行2 h缺血2 h再灌注。測定血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平，觀察各組氧化／抗氧化指標(biāo)及炎癥因子表達(dá)的差異性。結(jié)果D組SOD活性升高、MDA含量下降，與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；E組改變更明顯，和D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與B組比較，C、D、E組的IL-6、TNF-α明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；E組的各炎癥因子水平最高，與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論預(yù)缺血時間與氧化損傷的保護(hù)作用在一定時間窗內(nèi)呈平行關(guān)系，預(yù)缺血并無明顯抗炎作用，過長時間預(yù)缺血甚至能導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)；5 min／3個循環(huán)缺血預(yù)處理方案較為適宜。

大鼠；肢體；缺血再灌注；缺血預(yù)處理；保護(hù)機(jī)制

缺血預(yù)處理（ischemia preconditioning，IprC）是指在長時間缺血前對組織器官實(shí)施多次短暫的缺血來提高組織缺血耐受性、延緩或減輕隨后再灌注引起損傷的方法。自Murry et al［1］提出此概念以來，有關(guān)IprC時間和保護(hù)效應(yīng)之間關(guān)系的研究甚少。該研究擬觀察不同時間策略IprC后血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等水平的變化，從抗氧化損傷和炎癥反應(yīng)角度研究不同IprC時間下保護(hù)作用的差異性，探討相對合理的IprC時間，為臨床開展IprC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組40只成年健康SPF級SD大鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重220～250 g，雌雄不限，隨機(jī)均分成5組，正常對照組（A組）：僅行開腹，分離腹主動脈不夾閉；缺血再灌注組（B組）：夾閉腹主動脈缺血2 h后再灌注2 h；1 min／3個循環(huán)預(yù)處理組（C組）：1 min阻斷、1 min灌注交替共3個循環(huán)，然后正式阻斷2 h、再灌注2 h；5 min／3個循環(huán)預(yù)處理組（D組）和10 min／3個循環(huán)預(yù)處理組（E組），方法均同C組，間隔時間改為5 min和10 min。

1.2 主要試劑SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-6、TNF-α、IL-10 ELISA檢測試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司。

1.3 動物模型制備術(shù)前禁食12 h，禁水2 h。腹腔10%水合氯醛麻醉后經(jīng)尾靜脈留置套管針。開腹分離腹主動脈，在腸系膜下動脈與雙髂分岔間用管夾阻斷腹主動脈2 h，復(fù)通2 h為缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)過程關(guān)閉腹腔，以微量輸液泵經(jīng)尾靜脈持續(xù)補(bǔ)液（8 ml／kg）。

1.4 動物處理及標(biāo)本采集各組均在最終恢復(fù)血循環(huán)后經(jīng)下腔靜脈采血4～5 ml，血標(biāo)本放入普通冰箱冷藏靜置30 min后3 000 r／min離心15 min，取上清液，裝入EP管并標(biāo)記，－80℃保存待測。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 血清SOD、MDA檢測 采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA濃度，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 血清IL-6、TNF-α、IL-10濃度檢測 使用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA），用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各標(biāo)本的IL-6、TNF-α、IL-10濃度。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，所有分組均進(jìn)行K-S檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD法單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組血清SOD和MDA的比較與A組比較，B組的SOD活力下降，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的SOD活力升高，MDA含量下降，其中C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；C、D、E組進(jìn)行組間比較，E組的SOD活力最高、MDA含量最低，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組血清SOD和MDA比較（n＝8，±s）

表1 各組血清SOD和MDA比較（n＝8，±s）

與A組比較：＃P＜0.05；與B組比較：*P＜0.05；與C組比較：△P＜0.05；與D組比較：▲P＜0.05

組別SOD（U／ml）MDA（nmol／ml）A 105.14±11.892.79±0.21 B 56.02±7.87＃4.32±0.22＃60.27±9.16＃4.16±0.22＃D C 71.92±10.33＃*△3.77±0.15＃*△E 74.99±12.62＃*△▲3.62±0.13＃*△▲

2.2 各組IL-6、TNF-α、IL-10的比較與A組比較，B組的IL-6、TNF-α、IL-10水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的IL-6、TNF-α明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C、D、E進(jìn)行組間比較，各數(shù)值均呈遞增趨勢，IL-6水平D組和C組比較、E組和D組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。D組和C組TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），E組和D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-10水平各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組血清IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（n＝8，ng／L，±s）

表2 各組血清IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（n＝8，ng／L，±s）

與A組比較：＃P＜0.05；與B組比較：*P＜0.05；與C組比較：△P＜0.05；與D組比較：▲P＜0.05

組別IL-6TNF-αIL-10 A66.66±9.79113.66±10.2094.57±11.91 B94.31±8.40＃170.32±10.87＃121.45±12.31＃C108.05±11.80＃*185.67±15.38＃127.93±13.82＃D113.90±7.02＃*191.50±11.86＃*140.68±10.82＃*△E118.59±9.20＃*△204.48±10.74＃*△▲156.24±11.56＃*△▲

3 討論

在心血管外科領(lǐng)域中，如腹主動脈及髂動脈瘤人工血管置換、建立體外循環(huán)的心臟手術(shù)，動脈栓塞取栓、動脈閉塞性疾病行旁路手術(shù)等眾多情況，機(jī)體都將不可避免的要遭受缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI），若控制不良還會帶來全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及多器官功能障礙綜合征（multiple organs dysfunction syndrome，MODS）等后果。缺血再灌注過程中產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）。攻擊生物膜導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，其產(chǎn)物MDA水平的高低間接反映了ROS對細(xì)胞的損傷程度。生理狀態(tài)下的ROS能被以SOD為主的抗氧化系統(tǒng)所清除，當(dāng)ROS超過機(jī)體的清除能力后即出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)、抗氧化能力減弱的失衡狀態(tài)，監(jiān)測MDA和SOD判斷機(jī)體的氧化與抗氧化狀態(tài)。此外，缺血會釋放多種炎癥細(xì)胞因子，其中IL-6和TNF-α是早期釋放的重要致炎因子，而IL-10是有代表性的抑炎因子［2］。

有研究［3－5］顯示IprC是減輕缺血再灌注損傷的有效措施，眾多學(xué)者探索其保護(hù)機(jī)制，認(rèn)為和減輕脂質(zhì)過氧化、抑制細(xì)胞凋亡、增加內(nèi)源性腺苷釋放、激活蛋白激酶C調(diào)控細(xì)胞凋亡、開放線粒體K-ATP通道、維持靶缺血肌肉組織的糖原儲備、增加缺氧狀態(tài)下的無氧酵解等因素有關(guān)。現(xiàn)行下肢I(xiàn)prC的方法主要有腹主動脈下端預(yù)阻斷、髂動脈預(yù)阻斷、股動脈預(yù)阻斷、下肢無創(chuàng)止血帶預(yù)阻斷等，阻斷策略不一，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。IprC的保護(hù)效應(yīng)有早期保護(hù)和延遲保護(hù)兩個時間窗，早期保護(hù)持續(xù)時間在預(yù)缺血的1～2 h內(nèi)，起主要作用。延遲保護(hù)在24～72 h，又稱“第二窗口保護(hù)期”，兩個時相保護(hù)機(jī)制有所不同［6］，也間接表明長時間的IprC可能無益。

本研究顯示，5 min／3個循環(huán)IprC能明顯增強(qiáng)SOD活性，并降低MDA水平，發(fā)揮了很好的清除氧自由基、抗氧化作用，10 min／3個循環(huán)時更明顯，由此觀察預(yù)缺血時間對下肢氧化損傷的保護(hù)作用呈遞增趨勢，但炎癥因子在10 min／3個循環(huán)IprC時最高，過長時間的預(yù)缺血導(dǎo)致了炎癥因子的蓄積，這可能抵消了IprC的預(yù)期保護(hù)效果。戚煒［7］認(rèn)為短時間（5～15 min／3個循環(huán)）的IprC可一定程度降低氧自由基水平，減輕缺血再灌注損傷，而20 min／3個循環(huán)以上的IprC則無此作用。也有學(xué)者提出IprC可能通過降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)途徑達(dá)到心肌細(xì)胞保護(hù)的效果［8］，這與IprC促進(jìn)了IL-10的釋放發(fā)揮了一定的抑制炎癥作用有關(guān)，和本研究結(jié)果不矛盾。提示小于5 min／3個循環(huán)的IprC可能有一定程度的抗炎作用，長時間IprC后IL-10的升高不足以抑制IL-6、TNF-α等致炎因子的過度表達(dá)，抗炎作用并不明顯。

IprC雖已被認(rèn)為能減輕機(jī)體缺血再灌注損傷，但I(xiàn)prC的過程中會潛在的伴隨著炎癥反應(yīng)和其他損害的發(fā)生，過長時間的IprC會增加負(fù)面效應(yīng)。本研究闡釋的IprC保護(hù)機(jī)制主要來自其抗氧化清除氧自由基的作用，雖有一定程度抑制性炎癥因子的釋放，但不足以減輕術(shù)后的炎癥反應(yīng)。IprC時間長短直接影響了保護(hù)效應(yīng)，本研究中的1 min／3個循環(huán)抗氧化作用甚微，5 min／3個循環(huán)的IprC發(fā)揮了顯著抗氧化保護(hù)效應(yīng)，10 min／3個循環(huán)雖然作用更優(yōu)，但是長時間的IprC導(dǎo)致機(jī)體IL-6、TNF-α等致炎因子大量蓄積，加重了炎癥反應(yīng)，增加了術(shù)后發(fā)生SIRS的風(fēng)險(xiǎn)。本研究不足之處在于未能進(jìn)行組織病理學(xué)分析，IprC作為一項(xiàng)新興的預(yù)保護(hù)措施需更多的研究來證實(shí)其可靠性，臨床應(yīng)全面權(quán)衡缺血預(yù)處理保護(hù)作用及其潛在的負(fù)面影響而進(jìn)行合理運(yùn)用。

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Association between ischemic preconditioning time and the protective effects of hind limb ischemia／reperfusion injury in rats

Si Xiaomao1，2，Qiu Peng1，Zhu Huagang1，et al
（1Dept of Vascular Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2The TCM Hospital of Nanling County Wuhu City，Nanling 241300）

ObjectiveTo investigate the relationship between different ischemic preconditioning protocols and the protective effects of hind limb ischemia／reperfusion injury in rats in purpose of choosing an optimal ischemic preconditioning scheme.MethodsAn experimental study was designed using 40 SD rats divided in five groups（n＝8）.Group A：the sham group，laparotomy and separating the abdominal aorta without clamping for 240 minutes （min）.Group B：ischemia／reperfusion，rats submitted to ischemia for 120 min and reperfusion for 120 min.Group C，D and E：animals submitted to three cycles of clamping and releasing the aorta for 1，5 and 10 min respectively before being submitted to the ischemia／reperfusion procedure；the oxidative damage，inflammatory and protective effects among five groups were evaluated by measuring serum levels of SOD，MDA，IL-6，TNF-α，IL-10.ResultsCompared with group B，SOD activities were significantly higher in group D（P＜0.05），SOD activities were significantly higher in group E compared with group D（P＜0.05）.Compared with group B，the level of IL-6，TNF-α increased obviously in group C，D，E（P＜0.05）.IL-6，TNF-α，IL-10 was the highest in group E among five groups（P＜0.05）.ConclusionThe relationship between ischemia preconditioning time and anti-oxidation in hind limb ischemia／reperfusion injury seems paralleled.The inflammatory response accompanied with the ischemia preconditioning becomes serious with ischemia time prolonging.Preconditioning doesn′t show anti-inflammatory effect.Five min／three circulation ischemia preconditioning scheme is an optimal protocol.

rats；hind limb；ischemia／reperfusion；ischemic preconditioning；protective mechanism

R 364.12；R 364.5；R 543.5

1000－1492（2014）05－0569－03

2014－02－17接收

安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（編號：2010B17）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管外科，合肥 2300222安徽省南陵縣中醫(yī)院普外科，南陵 241300

司小毛，男，醫(yī)師，碩士研究生；

朱化剛，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：huagzhu＠yeah.net