汪小五，曾憲聰，陳 偉，張 瑩，吳 悅，杜愛能，劉璐璐，王林定

卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒ORFK12蛋白初步研究

汪小五，曾憲聰，陳 偉，張 瑩，吳 悅，杜愛能，劉璐璐，王林定

目的研究卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）ORFK12基因在大腸桿菌的表達(dá)及表達(dá)的蛋白在普通人群中檢測KSHV的感染情況。方法設(shè)計(jì)一對特異性引物，以BCBL-1細(xì)胞總DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增KSHV ORFK12基因。構(gòu)建含目的基因的重組質(zhì)粒命名為PQE-80L-K12和誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。采用ELISA法和Western blot法篩查臨床收集的血清標(biāo)本中感染KSHV的情況。結(jié)果異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后的PQE-80L-K12重組菌經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示有一個(gè)約10 ku的融合表達(dá)蛋白為ORFK12蛋白。采用ELISA法和Western blot法檢測顯示ORFK12蛋白能與KSHV陽性血清反應(yīng)。結(jié)論KSHV ORFK12基因在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的ORFK12蛋白在實(shí)驗(yàn)室檢測感染KSHV有一定的輔助作用。

卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒；ORFK12基因；ORFK12蛋白

卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）是由美國哥倫比亞大學(xué)華裔病理學(xué)家Chang等于1994年對卡波肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）組織中特異DNA進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)的，是雙鏈DNA病毒［1－2］。經(jīng)研究［3］顯示KSHV是KS、原發(fā)滲液性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）、多中心卡斯特慢病（multicentric Castleman disease，MCD）的病原體。K12基因編碼的蛋白被稱為卡波濟(jì)蛋白，它是KSHV感染潛伏期所特有的蛋白［4］，幾乎在所有的KS紡錘樣細(xì)胞和潛伏感染的原發(fā)滲液性淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)［5］。筆者通過對KSHV K12基因進(jìn)行基因擴(kuò)增，誘導(dǎo)其表達(dá)，表達(dá)蛋白檢測與血清的反應(yīng)情況，為研究KSHV的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源細(xì)胞系BCBL-1、表達(dá)載體PQE-80L質(zhì)粒、宿主大腸桿菌DH5a、BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存；pEASY-T1 simple cloning kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA購自美國GE公司。

1.2 工具酶和試劑BamHⅠ、SalⅠ購自美國Fermentas公司；質(zhì)粒小抽提取試劑盒購自美國Axygen有限公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗人IgG抗體、堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記的山羊抗人IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 重組T質(zhì)粒的構(gòu)建和重組質(zhì)粒PQE80-L-K12的構(gòu)建及表達(dá)與純化

1.3.1 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 參照NCBI上的K12序列設(shè)計(jì)引物如下，上游引物：5′-TTGGATCCATGGATAGAGGCTTAACG-3′；下游引物：5′-TTGTCGACTTAGTGCGCGCCCGTTGC-3′（下劃線部分分別為BamHⅠ、SalⅠ的酶切位點(diǎn)），以BCBL-1細(xì)胞總DNA為模板，按照設(shè)計(jì)好的K12序列的上、下游引物送至上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min，然后94℃1 min，50℃30 s，72℃1 min熱循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小正確，用膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.3.2 重組T質(zhì)粒的構(gòu)建 切膠回收的PCR產(chǎn)物PCR-K12與pEASY-T1載體用T4連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，鋪板于氨芐（Amp）抗性的LB培養(yǎng)基平板上（鋪板前在LB培養(yǎng)基平板上均勻涂布8 μl的500 mmol／L IPTG和40 μl的20 mg／ml半乳糖苷酶（X-gal）混合液，用于藍(lán)白斑篩選），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取白斑單菌落轉(zhuǎn)接于3 ml含Amp的LB培養(yǎng)基上37℃恒溫?fù)u床200 r／min培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，用BamHⅠ、SalⅠ做雙酶切鑒定。酶切正確的重組T質(zhì)粒做基因測序進(jìn)一步鑒定。

1.3.3 重組質(zhì)粒PQE-80L-K12的構(gòu)建 PQE-80L表達(dá)載體和測序正確重組T質(zhì)粒用BamHⅠ、SalⅠ同時(shí)做雙酶切，回收雙酶切后的PQE-80L的載體和目的基因ORFK12用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，其后的構(gòu)建過程如構(gòu)建重組T質(zhì)粒過程一樣，同樣提取質(zhì)粒做雙酶切和測序鑒定。

1.3.4 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白純化 經(jīng)鑒定的重組PQE-80L-K12轉(zhuǎn)化菌接種于3 ml含有Amp青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床200 r／min培養(yǎng)過夜后。將過夜培養(yǎng)物取60 μl轉(zhuǎn)入3 ml含Amp青霉素的LB液體培養(yǎng)基中（轉(zhuǎn)種比例1∶50），培養(yǎng)3 h后，取出1 ml培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)前樣品后，按1∶1 000比例加入IPTG誘導(dǎo)劑，其終濃度為1 mmol／L。37℃、200 r／min搖床繼續(xù)培養(yǎng)8 h，再取1 ml培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)后的樣品。誘導(dǎo)前樣本和誘導(dǎo)后樣本SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況，確認(rèn)蛋白已表達(dá)后，次日擴(kuò)大培養(yǎng)（500 ml LB培養(yǎng)液）。

表達(dá)蛋白制備：收集擴(kuò)大培養(yǎng)的表達(dá)菌體（500 ml LB培養(yǎng)液），在4℃、7 000 r／min離心15 min，棄上清液，用100 ml裂解緩沖液（非變性）裂解沉淀，蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1 mmol／ml，加入溶菌酶至終濃度1 mg／ml。冰上放置40 min。用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，功率300 W，超聲3 s間隔10 s，破碎3次。于4℃以8 000 r／min離心15 min之后，用滅菌的移液槍將上清液移至50 ml的離心管里，再用0.45 μm的濾膜過濾即為上清粗蛋白，留下的沉淀加50 ml變性的裂解緩沖液室溫溶解，8 000 r／min離心15 min后取上清液并且用0.45 μm的濾膜過濾后即為包涵體粗蛋白。10 μl的上清粗蛋白和10 μl的包涵體粗蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE電泳確定目的蛋白的表達(dá)位置。

用10倍柱體積的超純水清洗柱子，將已預(yù)處理好的Ni-NTA懸浮液混勻填裝柱子，體積約1.5 ml。將包涵體蛋白樣品或者上清蛋白樣品經(jīng)過Ni-NTA柱進(jìn)行純化。依次用5倍柱體積的裂解緩沖液，5倍柱體積的洗脫緩沖液過柱，洗脫雜蛋白。最后用5倍柱體積的洗脫液緩沖液洗脫吸附在Ni柱中的目的蛋白，分管收集樣品。純化的蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳鑒定。

1.4 ELISA法篩查臨床血清標(biāo)本包被：上述純化的含目的蛋白樣品用pH 9.6的包被緩沖液稀釋到1 ng／μl，將其作為抗原，在96孔酶標(biāo)板中加入50 μl，4℃包被過夜；洗板：PBS-T洗板5次；封閉：每孔加入250 μl含5%脫脂奶粉和1%山羊血清的PBS溶液，37℃孵育1 h；洗板：PBS-T洗板5次；第一抗體結(jié)合：利用本實(shí)驗(yàn)室制備的KSVH ORF65、ORF73 和ORFK8.1蛋白作為抗原從蚌埠地區(qū)普通人群血清中篩選的KSHV陽性，陰性血清（包括32份陽性和32份陰性）作為一抗，其血清按1∶100比例稀釋，每孔加入50 μl，37℃孵育1 h；洗板：PBS-T洗板5次；第二抗體結(jié)合：采用AP標(biāo)記的山羊抗人的抗體作為二抗，按1∶2 000比例每孔加入50 μl，37℃孵育1 h；洗板：PBS-T洗板5次；顯色：以p-NPP作為顯色劑，用顯色緩沖液稀釋到1 mg／ml后每孔加入50 μl，37℃孵育15 min，加入3 mol／L NaOH溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測405 nm處的吸光度（optical density，OD）值。每份樣本重復(fù)3次。分析純化的目的蛋白與血清里的相應(yīng)抗體的反應(yīng)情況。結(jié)果判定：以陰性樣品OD值平均值加上5倍標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，STD）為Cut-Off值。樣品OD值高于Cut-Off值則認(rèn)為該血清與ORFK12基因表達(dá)的蛋白有反應(yīng)。有反應(yīng)的陽性血清和無反應(yīng)的陰性血清用于Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)其與血清的反應(yīng)情況。

1.5 Western blot法鑒定ORFK12蛋白與血清的反應(yīng)性純化了的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜放在封閉液中封閉2 h，與1∶100稀釋的從以上利用ELISA法篩選出的10份有反應(yīng)的陽性血清和無反應(yīng)的陰性血清隨機(jī)各取3份作為一抗4℃孵育過夜。再與HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體（1∶20 000）室溫孵育1 h，將化學(xué)發(fā)光底物試劑加至PVDF膜上。把X線片覆蓋在膜上壓緊曝光，拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 KSHV ORFK12基因PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)了約183 bp大小的條帶，與預(yù)期的183 bp擴(kuò)增片段大小一致。見圖1A。

2.2 重組T質(zhì)粒酶切和測序鑒定重組轉(zhuǎn)化菌經(jīng)LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用BamHⅠ、SalⅠ做雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)兩條特異性條帶，其中一條約為5 100 bp，還有一條約為183 bp，證明KSHV ORFK12基因已經(jīng)與T載體連接成功。酶切有目的條帶的重組T質(zhì)粒拿到公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確。見圖1B。

2.3 重組PQE-80L-K12質(zhì)粒酶切和測序鑒定提取重組質(zhì)粒，同樣用BamHⅠ、SalⅠ做雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果出現(xiàn)其中一條約為5 000 bp，還有一條約為183 bp，證明KSHV ORFK12基因已經(jīng)PQE-80L表達(dá)載體連接成功。酶切有目的條帶的重組質(zhì)粒拿到公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確。見圖1C。

圖1 ORFK12目的基因PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)及純化含目的基因KSHV ORFK12基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21受體菌中，經(jīng)終濃度1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳鑒定，重組蛋白以包涵體形式表達(dá)。包涵體經(jīng)0.45 μm的濾膜濾過后的包涵體粗蛋白經(jīng)過Ni親和層析填料純化后得到了約10 ku的蛋白，箭頭處指的是表達(dá)的目的蛋白ORFK12蛋白。見圖2。

圖2 KSHV ORFK12蛋白的表達(dá)與純化

2.5 ELISA法篩查臨床血清情況以純化的蛋白作為抗原，采用ELISA法檢測64份血清樣本中KSHV感染情況的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)32份陽性血清中有10份檢測后OD值高于臨界值（Cut-Off值為0.705），32份陰性血清經(jīng)檢測后OD值低于Cut-Off值。

2.6 Western blot鑒定ORFK12蛋白與血清的反應(yīng)性純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，進(jìn)行Western blot鑒定，純化的蛋白與KSHV陽性血清有反應(yīng)印跡，與KSHV陰性血清沒有反應(yīng)印跡，初步證明KSHV ORFK12基因表達(dá)蛋白與血清中相應(yīng)抗體有反應(yīng)性。見圖3。

圖3 Western blot檢測ORFK12蛋白與KSHV＋和KSHV-血清

3 討論

KSHV又稱人類皰疹病毒8型病毒，屬于γ皰疹病毒亞科，是雙鏈DNA病毒［6］。KSHV在部分非洲和歐洲尤其是意大利和南部地中海國家比較常見。目前我國對KSHV的研究才開始不久，有研究［7］表明新疆地區(qū)經(jīng)典型KS的發(fā)病率較高，而其他地區(qū)和民族的KS病例則比較罕見。KS是一種在感染AIDS患者中常見的腫瘤，致病機(jī)制很復(fù)雜［4］。KSHV的研究已經(jīng)有不少報(bào)道如ORFK8.1基因、ORFK73基因［1，8-10］。針對于KSHV編碼的蛋白可以分為潛伏感染相關(guān)蛋白和裂解感染相關(guān)蛋白［11］。

筆者通過PCR技術(shù)、ELISA法和Wersten blot法［1］構(gòu)建含有目的基因的T載體和PQE-80L表達(dá)載體并檢測了重組蛋白與血清抗體反應(yīng)情況。利用KSHV ORF65、ORF73和ORFK8.1蛋白為抗原從蚌埠地區(qū)普通人群血清中篩查出陽性血清和陰性血清各32份。以O(shè)RFK12蛋白為抗原，用ELISA法篩查此64份血清，待測樣品OD值高于Cut-Off值則判定為陽性，結(jié)果在32份經(jīng)KSHV ORF65、ORF73和ORFK8.1蛋白為抗原篩查出的陽性血清中有10份的陽性血清OD值高于Cut-Off值即有反應(yīng)，其中有22份沒有反應(yīng)，即用ORFK12基因表達(dá)的蛋白從普通人群中篩選出KSHV陽性血清明顯有漏檢情況［7］，說明ORFK12蛋白為抗原ELISA法篩查普通人群KSHV感染的靈敏度低。而經(jīng)KSHV ORF65、ORF73和ORFK8.1蛋白為抗原篩查出的32份陰性血清OD值都低于Cut-Off值，這說明ORFK12蛋白為抗原的ELISA法篩查普通人群感染KSHV特異性很強(qiáng)。ORFK12蛋白雖然用于流行病調(diào)查存在一定的局限性，不足以用于KSHV的檢測，但可以作為輔助檢查，因?yàn)槠銭LISA的特異性良好。ORFK12基因編碼的蛋白是潛伏期感染相關(guān)蛋白，有研究［12］表明ORFK12基因是誘導(dǎo)腫瘤形成的基因，卡波齊蛋白在90%艾滋病患者的KS中都表達(dá)，KSHV K12的表達(dá)對于KS發(fā)病具有較強(qiáng)的特異性。該研究通過驗(yàn)證ORFK12基因能夠成功表達(dá)ORFK12蛋白，而且確定該蛋白與血清相應(yīng)抗體有反應(yīng)，為KSHV致病機(jī)制的研究提供了一定依據(jù)。

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Preliminary study of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus ORFK12 protein

Wang Xiaowu，Zeng Xiancong，Chen Wei，et al
（Dept of Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo study the expression of ORFK12 gene of KSHV in E.coli and obtain KSHV seroprevalence in the general population in using the expressed protein.MethodsA pair of primers was designed to amplify ORFK12 gene by PCR，using the total DNA of BCBL-1 cells as template.Recombinant plasmid with the target gene was named PQE-80L-K12 and induced to express.In this study，antibodies to one protein of KSHV （ORFK12）were tested by indirect ELISA and Western blot.ResultsAfter using IPTG to induce express，PQE-80L-K12 recombinant bacteria had a fusion of 10 Ku protein by SDS-PAGE electrophoresis.10 specimens were tested.ConclusionIt is preliminarily proved that KSHV ORFK12 gene can express in E.coli，and ORFK12 protein infection KSHV plays certain supplementary role in laboratory tests.

Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus；ORFK12 gene；ORFK12 protein

R 373.4

1000－1492（2014）05－0565－04

2013－11－25接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81271837）；安徽省教育廳自然科學(xué)基金（編號：KJ2012A161）；安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（編號：XJ200914）

安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032

汪小五，女，碩士研究生；

王林定，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wanglinding＠ahmu.edu.cn