董紅嬌, 曾銳

(西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院, 四川 成都 610041)

坐珠達西組分的定性鑒別研究

董紅嬌, 曾銳

(西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院, 四川 成都 610041)

目的: 提高坐珠達西品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).方法: 采用薄層色譜法, 以對照品、對照藥材為對照, 對藏藥坐珠達西中訶子、余甘子、石榴子、安息香、木香、丁香、藏木香、藏紅花、牛黃、熊膽、甘青青蘭及蓽茇共12味藥材進行了定性鑒別, 并采用HPLC法對坐珠達西味藥中的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、綠原酸以及山奈酚, 以Kromasil C18色譜柱(4.6mm×250mm, 5μm)流動相甲醇-0.05%磷酸溶液, 梯度洗脫, 流速1mL·min-1, 西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ檢測波長為455nm, 綠原酸檢測波長為352nm, 山奈酚檢測波長為225nm, 進行定性鑒別.結(jié)果: 在與對照品或?qū)φ账幉南鄳?yīng)的位置上, 供試品顯現(xiàn)相同斑點, 且在HPLC中西紅花苷Ⅱ?qū)ψ檫_西的質(zhì)量貢獻尤為明顯.結(jié)論: 該鑒別方法分離度良好,準(zhǔn)確可靠, 可用于藏藥坐珠達西的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.

坐珠達西; 西紅花苷Ⅰ;西紅花苷Ⅱ; 綠原酸; 山奈酚

藏藥坐珠達西由訶子、余甘子、石榴子、安息香、紅花等35味藥物組成, 具有疏肝、健胃、清熱、愈潰瘍、消腫等功效, 主要用于治療“木布”病遷延不愈、胃脘嘈雜、消化不良、浮腫、水腫等癥, 為藏藥治療慢性胃炎的常用藥物.薄層色譜鑒別法是一種通過供試品與對照品或?qū)φ账幉脑谙鄳?yīng)位置顯示相同斑點, 來定性鑒別某種藥物有無的一種檢驗方法, 具有操作簡便、準(zhǔn)確快捷等特點, 廣泛用于藥物的區(qū)分鑒別.為保證藥物療效, 本課題通過查閱相關(guān)資料, 最終對坐珠達西方中具有明顯抗胃炎的木香、安息香等, 及貴重藥物牛黃、熊膽等共12味藥物進行了系統(tǒng)的定性鑒別, 并對藏紅花中的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、綠原酸以及山奈酚采用高效液相方法進行了定性鑒別.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZF1-Ⅱ紫外分析儀(上海嘉騰科技有限公司); 硅膠G、GF254、H(青島海洋化工廠分廠), 聚酰胺薄膜(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠出品); Waters 2695/2996型高效液相色譜儀, 2996PDA檢測器, Empower化學(xué)工作站.

1.2 試藥

沒食子酸(批號：111109, 四川省維克奇生物科技有限, HPLC≥98%), 苯甲酸(批號：120807, 四川省維克奇生物科技有限, HPLC≥98%), 木香烴內(nèi)酯(批號：120322, 四川省維克奇生物科技有限, HPLC≥98%), 去氫木香烴內(nèi)酯(批號：120321, 四川省維克奇生物科技有限, HPLC≥98%), 齊墩果酸(批號：MUST-13041606, 成都曼思特生物科技有限公司/中國科學(xué)院成都生物研究所, HPLC≥98%), 胡椒堿(批號：130829, 成都普菲德生物技術(shù)有限公司, HPLC≥98%)對照品; 坐珠達西供試品(批號：20120618, 四川阿壩州藏醫(yī)院藏醫(yī)藥研究所制); 西紅花苷Ⅰ(批號：120714, 純度≥98.0%), 西紅花苷Ⅱ(批號：110925, 純度≥98.0%)對照品(四川省維克奇生物科技有限);綠原酸(批號：121125, 純度≥98.0%), 山奈酚(批號：120718, 純度≥98.0%).

2.1 訶子、余甘子、石榴子的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末0.5g, 加甲醇10mL, 超聲20min, 濾過, 水浴揮桿溶劑, 加1mL乙醇溶解, 為供試品溶液.

2.1.2 對照品溶液制備

取沒食子酸對照品0.5mg, 加乙醇制成1mg·mL-1的溶液, 作為對照品溶液.

2.1.3 對照藥材溶液制備

取訶子、余甘子、石榴子藥材粉末2g, 按2.1.1項下方法制得對照藥材溶液.

2.1.4 陰性樣品溶液

按樣品處方配比, 稱取不含訶子、余甘子、石榴子的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑,按2.1.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.1.5 薄層鑒別及結(jié)果

參照文獻[1-5], 將上述供試品溶液, 對照品溶液, 對照藥材溶液, 陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一聚酰胺薄層板上, 以乙酸乙酯-甲酸(3:1)為展開劑, 上行展開一次, 取出, 晾干, 噴以2%三氯化鐵乙醇溶液, 日光下檢視, 斑點呈藍色; 在與對照品, 對照藥材相應(yīng)的位置上, 供試品色譜均顯示相同顏色的斑點, 結(jié)果見圖1.

2.2 安息香的薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末0.5g, 加甲醇4mL, 超聲5min, 濾過, 取濾液作為供試品溶液.

2.2.2 對照品溶液制備

稱取苯甲酸對照品, 加甲醇制成4mg·mL-1的溶液, 作為對照品溶液.

2.2.3 對照藥材溶液制備

取安息香藥材粉末0.5g, 按2.2.1項下方法制得對照藥材溶液.

2.2.4 陰性樣品溶液

按樣品處方配比, 稱取不含安息香的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑, 按2.2.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.2.5 薄層鑒別及結(jié)果

依照藥典中薄層色譜法[6], 將以上供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠GF254薄層板上, 以石油醚(60-90℃)-正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(6:4:3:0.5)為展開劑, 取出, 晾干,以紫外燈(254nm)下檢視;在與對照品, 對照藥材相應(yīng)的位置上, 供試品色譜均顯示相同顏色的斑點, 結(jié)果見圖2.

2.3 木香的薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末0.5g, 加氯仿10mL, 超聲30min, 取上清液為供試品溶液.

2.3.2 對照品溶液制備

取木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯對照品, 分別加氯仿制成0.5mg·mL-1的溶液, 作為對照品溶液.

2.3.3 陰性樣品溶液

按樣品處方配比, 稱取不含木香的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑, 按2.5.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.3.4 對照藥材溶液制備

取木香藥材粉末0.5g, 按2.3.1項下方法制得對照藥材溶液.

2.3.5 薄層鑒別及結(jié)果

參照文獻[7-8], 將上述供試品溶液, 對照品溶液, 對照藥材溶液, 陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠G薄層板上, 以氯仿-環(huán)己烷(9:1)為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 噴以1%香草醛硫酸溶液, 105℃加熱至斑點顯色清晰; 木香普通薄層鑒別在與對照品相應(yīng)的位置上, 供試品色譜顯示相同顏色的斑點, 結(jié)果見圖3.

圖1 訶子、余甘子、石榴子薄層圖譜Fig.1 TLC chromatogram of myroblan, emblic leafflowerfruit, pomegranate seed

圖2 安息香薄層圖譜Fig.2 TLC chromatogram of benzoin

2.4 丁香的薄層鑒別

2.4.1 供試品溶液制備 取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末0.5g, 加無乙醚5mL, 振搖數(shù)分鐘, 過濾, 濾液作為供試品溶液.

2.4.2 陰性樣品溶液 按樣品處方配比, 稱取不含丁香的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑,按2.9.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.4.3 薄層鑒別及結(jié)果 依照藥典中薄層色譜法, 將上述供試品溶液, 對照藥材溶液, 陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠G薄層板上, 以石油醚-乙酸乙酯(9:1)為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 噴以5%香草醛硫酸溶液,105℃加熱至斑點顯色清晰; 在與對照藥材相應(yīng)的位置上, 供試品色譜中均顯相同顏色的斑點, 結(jié)果見圖4.

圖3 木香薄層圖譜Fig.3 TLC chromatogram of elecampane

圖4 丁香薄層圖譜Fig.4 TLC chromatogram of dove

2.5 藏木香的薄層鑒別

2.5.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末0.5g, 加氯仿25mL, 超聲30min, 過濾, 濾液濃縮至2mL,作為供試品溶液.

2.5.2 對照品溶液制備

取土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯對照品, 分別加氯仿制成1mg·mL-1的溶液, 作為對照品溶液.

2.5.3 陰性樣品溶液

按樣品處方配比, 稱取不含藏木香的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑, 按2.6.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.5.4 薄層鑒別及結(jié)果

參照文獻[9], 將上述供試品溶液, 對照品溶液, 對照藥材溶液, 陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠G薄層板上, 以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(5:2)為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 噴以5%香草醛硫酸溶液, 105℃加熱至斑點顯色清晰, 結(jié)果見圖5.

2.6 藏紅花的薄層鑒別

2.6.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末0.5g, 加80%丙酮溶液5mL, 密塞, 振搖15min, 靜置, 取上清液作為供試品溶液.

2.6.2 對照藥材溶液制備

取藏紅花對照藥材0.5g, 按2.3.1項下方法配制, 吸取上清液1mL定容至10mL作為對照藥材溶液.

2.6.3 陰性樣品溶液制備

按樣品處方配比, 稱取不含藏紅花的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑, 按2.3.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.6.4 薄層鑒別及結(jié)果

依照藥典中紅花薄層色譜法, 將以上供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠H薄層板上, 以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7:2:3:0.4)為展開劑, 展開, 取出, 晾干.在與對照藥材相應(yīng)的位置上, 供試品中顯相同顏色的斑點, 結(jié)果見圖6.

圖5 藏木香薄層鑒別圖譜Fig.5 TLC chromatogram of Tibet inula root

圖6 藏紅花薄層鑒別圖譜Fig.6 TLC chromatogram of saffron crocus

2.7 牛黃、熊膽的薄層鑒別

2.7.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末2g, 加乙醇20mL, 超聲10min, 濾過, 濾液蒸干, 殘渣加10%氫氧化鈉溶液20mL,置水浴上加熱回流水解6h, 冷卻, 滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-3, 用乙酸乙酯萃取2次, 每次15mL, 合并乙酸乙酯溶液, 蒸干, 殘渣加乙醇5mL使溶液, 靜置, 取上清液作為供試品溶液.

2.7.2 對照品溶液制備

稱取膽酸和去氧膽酸對照品, 各加乙醇制成1mg·mL-1的溶液, 作為對照品溶液.

2.7.3 陰性樣品溶液

按樣品處方配比, 稱取不含牛黃、熊膽的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑, 按2.4.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.7.4 薄層鑒別及結(jié)果

參照文獻[10-11], 將上述供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠G薄層板上, 以氯仿-甲醇-水(15:9:2)為展開劑, 上行展開, 取出, 晾干, 噴以10%硫酸乙醇溶液, 吹干, 日光下檢視, 結(jié)果見圖7、8.

圖7 牛黃薄層鑒別圖譜Fig.7 TLC chromatogram of bezoar

圖8 熊膽薄層鑒別圖譜 Fig.8 TLC chromatogram of felurs

2.8 甘青青蘭的薄層鑒別

2.8.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末1g, 加甲醇25mL, 超聲30min, 過濾, 濾液濃縮至2mL,作為供試品溶液.

2.8.2 對照品溶液制備

取齊墩果酸對照品, 分別加甲醇制成1mg·mL-1的溶液, 作為對照品溶液.

2.8.3 陰性樣品溶液

按樣品處方配比, 稱取不含甘青青蘭的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑, 按2.7.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.8.4 薄層鑒別及結(jié)果

參照文獻[12], 將上述供試品溶液, 對照品溶液, 對照藥材溶液, 陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠G薄層板上, 以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14:4:0.5)為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 噴以10%硫酸乙醇溶液, 105℃加熱至斑點顯色清晰, 結(jié)果見圖9.

2.9 蓽茇的薄層鑒別

2.9.1 供試品溶液制備

取坐珠達西丸劑, 研磨成分, 取粉末1g, 加無水乙醇25mL, 超聲30min, 過濾, 濾液濃縮至2mL,作為供試品溶液.

2.9.2 對照品溶液制備

取胡椒堿對照品, 分別加無水乙醇制成1mg·mL-1的溶液, 作為對照品溶液.

2.9.3 陰性樣品溶液

按樣品處方配比, 稱取不含蓽茇的其他藥材, 模擬生產(chǎn)工藝制成坐珠達西陰性對照丸劑, 按2.8.1項下方法制成陰性樣品溶液.

2.9.4 薄層鑒別及結(jié)果

參照文獻[13], 將上述供試品溶液, 對照品溶液, 對照藥材溶液, 陰性樣品溶液各約吸取5μL, 分別點于同一硅膠G薄層板上, 以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7:2:1)為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 噴以10%硫酸乙醇溶液, 加熱至斑點顯色清晰, 結(jié)果見圖10.

圖9 甘青青蘭薄層鑒別圖譜Fig.9 TLC chromatogram of dracocephalum tanguticum maxim

圖10 蓽茇蘭薄層鑒別圖譜Fig.10 TLC chromatogram of fructus piperis longi

2.10 西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ綠原酸以及山奈酚的液相色譜鑒別[15]

2.10.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱(4.6×250mm,5μm); 流動相甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脫, 0～8min, 13%～20%A; 8～20min, 20%～38%; 20～30min, 38%A～50%A; 30～45min, 50%A～70%A; 45～65min, 70%A～80%A; 流速為1mL·min-1; 柱溫30℃; 進樣量10μL; 西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ檢測波長為455nm, 綠原酸檢測波長為352nm,山奈酚檢測波長為225nm.

2.10.2 對照品溶液的制備

取綠原酸、山萘酚適量, 精密稱定, 加甲醇制成每1mL含1.102, 1.080 mg的溶液; 再取西紅花苷I 、西紅花苷II 適量, 精密稱定, 加稀乙醇制成每1mL含1.070, 1.064mg的溶液, 即得各對照品溶液.分別精密吸取上述對照品溶液各1.3, 1.7, 0.5, 0.2mL于25mL量瓶中, 加甲醇定容至刻度, 即得混合對照品溶液.

2.10.3 供試品溶液的制備

取坐珠達西粉末1.0g, 精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 精密加入甲醇25mL, 密封, 稱重, 超聲提取30min.冷卻至室溫后稱重, 用甲醇補足重量, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液即得.

2.10.4 測定結(jié)果

取上述對照品溶液及供試品溶液, 按“2.10.1”項下色譜條件, 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀, 測得液相色譜圖, 結(jié)果見圖11.結(jié)果表明, 西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、綠原酸以及山奈酚的色譜峰分離良好.

圖11 西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、綠原酸以及山奈酚HPLC圖譜Fig.11 HPLC chromatogram of Crocin Ⅰ, Crocin Ⅱ, Chlorogenic and Kaempferol

3 討論

1) 坐珠達西收載于衛(wèi)生部藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn), 由于歷史條件等限制, 原標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別只收錄1味藥物的鑒別.該藥由32味藥物組成, 其中訶子在藏藥中被視為“藥中之王”, 具有很好的解毒功效, 余甘子、石榴子、蓽茇、甘青青蘭、木香、藏木香、丁香、安息香等都對胃病具有很好的治療效果或協(xié)同作用, 紅花用來治療肝、血病, 且與牛黃、熊膽同為貴重藥物, 選取該12個藥物作為檢測對象, 從多方面考慮入手, 具有一定的科學(xué)意義.本實驗首次對坐珠達西這一藏醫(yī)臨床常用特色治療慢性胃病的仁青類藥物進行了較系統(tǒng)的薄層鑒別方法研究, 檢測指標(biāo)多, 總藥物數(shù)量的1/3, 可有效的控制坐珠達西的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 同時為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測定, 成分鑒別等提供一定的參考依據(jù).

2) 薄層色譜方法簡便快捷, 成本低, 尤其便于在基層藏醫(yī)院和研究所推廣使用. 坐珠達西處方中多數(shù)藥物的的薄層鑒別方法藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)中并沒有收載, 同時考慮訶子等藥物在藥典中的處理方法較為復(fù)雜, 故本次試驗中在參考文獻報道的基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化研究, 進一步簡化實驗操作過程, 本方法具有在基層醫(yī)療和生產(chǎn)單位實際推廣使用價值.

3) 本實驗還對訶子、余甘子、石榴子、安息香、木香、丁香進行了薄層色譜的抗氧化鑒別, 但由于方法不成熟, 暫不列入標(biāo)準(zhǔn)正文.坐珠達西處方中西紅花具有活血化瘀, 清熱解毒, 解郁安神的作用, 為方中的主藥且為貴重藥材, 故本試驗以西紅花的主要有效成分西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、綠原酸以及山奈酚為指標(biāo), 進行了定性鑒別.

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Preliminary study for Tibetan medicine Zuozhudaxi

Dong Hong-jiao ,Zeng Rui
(Ethnic Medicine Instiute of Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,P.R.C)

Objective: To enhance the quality standard of Zuozhudaxi.Method: The study makes a qualitative identification for 12 crud drugs(myroblan, emblic leafflower fruit, pomegranate seed, benzoin, elecampane, dove, Tibet inula root, saffron crocus, bezoar, felursi, dracocephalum tanguticum maxim, fructus piperis longi) in “Zuozhudaxi” by TLC with reference substance and the HPLC analysis was performed on an Kromasil C18 (4.6mm×250mm, 5μm)column. The column temperatrue was set at 30 ℃. A mixture of methyl alcohol -0.05% phosphoric acid aqueous solution was used as the mobile phase gradient elute with the flow rate at 1mL·min-1, and detected by different UV wave length, i.e 445nm for Crocin Ⅰ, CrocinⅡ, 352nm for Chlorogenic acid, 225nm for Kaempferol. Result: The TLC indicated that 12 identified herbs could show the same colorpot as the control herbs or contrast in the same position, CrocinⅡcontributions to the quality of Zuozhudaxi particularly.Conclusion: This identification method is good separating degree, accurate and stable.It can be used for quality specification study for“Zuozhudaxi”.

Zuozhudaxi; crocinⅠ; crocinⅡ; chlorogenic acid; kaempferol.

R28, R29

A

1003-4271(2014)06-0853-08

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.06.10

2014-09-24

曾銳(1976-), 男, 漢族, 四川人, 副教授, 從事藥物制劑及民族藥的研究, E-mail: Mackzeng@gmail.com

課題得到國家“十二五”科技支撐計劃(No.2012BAI27B07)的資助