白云鵬 董 揚 張智長 楊慶誠 徐澤全 閻洪亮

. 骨腫瘤 Bone neoplasms .

朊蛋白 PrPc 在 Enneking III 期骨肉瘤中的表達及預后相關性分析

白云鵬 董 揚 張智長 楊慶誠 徐澤全 閻洪亮

目的探討朊蛋白 PrPc ( cellular prion protein ) 在 Enneking III 期骨肉瘤中的表達以及分析其與骨肉瘤轉移和患者預后的相關性。方法采用免疫組織化學法 ( SP 法 ) 對初診已發(fā)生肺轉移的 Enneking III期骨肉瘤15 例以及相應瘤旁組織中朊蛋白 PrPc 的表達進行檢測。同時，檢測同期收治的初診未轉移骨肉瘤標本 33 例作為對照組。比較已有轉移的骨肉瘤和未轉移骨肉瘤中 PrPc 蛋白的表達水平。對 2006 年1 月至2009 年12 月收住院的兩組骨肉瘤患者的臨床資料進行回顧性分析。收集年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理性骨折、生存時間等資料。應用 Kaplan-Meier 法計算患者生存年率，應用 Log-rank 檢驗進行單因素分析，應用 Cox 回歸模型進行多因素分析，探討 PrPc 的表達和不同的臨床特征與骨肉瘤患者預后生存率之間的關系。結果PrPc 蛋白在骨肉瘤組織中普遍表達，在瘤旁組織中不表達；Enneking III 骨肉瘤中 PrPc 的表達要顯著高于 Enneking II 期對照組 ( P＝0.006 )。Kaplan-Meier 生存分析和 Log-rank 檢驗顯示 PrPc 的表達水平與骨肉瘤患者預后相關 ( P＝0.010 )，Enneking 分期與預后相關 ( P＝0.025 )。多因素分析顯示，PrPc 表達水平和腫瘤的 Enneking 分期可以作為骨肉瘤預后的獨立影響因素。結論朊蛋白 PrPc 在已有轉移的 Enneking III 骨肉瘤中的表達高于未轉移患者。PrPc 高表達的骨肉瘤患者預后較差。PrPc 的高表達可能與骨肉瘤預后不良有一定相關性。

骨肉瘤；基因表達；預后；朊蛋白

骨肉瘤是源于間葉組織以能產生骨樣組織的梭形基質細胞為特征的惡性腫瘤[1]。隨著新輔助化療的規(guī)范應用，手術理念和技術的日益進步，骨肉瘤總體預后有了較大的提高，5 年生存率從原來單純以截肢手術時的20% 提高到 60%～70%[2]，但那些就診時已經(jīng)發(fā)生肺轉移的患者死亡率仍居高不下[3]。朊蛋白 PrPc 是由位于20 號染色體上相間隔的兩個基因 PRNP，PRND 編碼的一類相對分子質量為 33 000～35 000 U 的蛋白質，傳統(tǒng)意義上認為它是引起傳染性海綿狀腦病 ( TSE ) 的病原體。近年來研究表明，PrPc 的過表達與人類多種癌癥如肺癌、胃癌、結腸癌、胰腺癌和前列腺癌[4]的發(fā)生和轉移有關，但在骨肉瘤中是否高表達，以及與骨肉瘤的肺轉移是否存在相關性至今仍無報道。

資料與方法

一、一般資料

2006 年1 月至 2009 年12 月，我院收治的骨肉瘤患者 48 例，男28 例，女20 例，就診時年齡7～55 歲。肱骨近端6 例，股骨遠端22 例，脛骨近端17 例，腓骨近端3 例。術前測量腫瘤體積，最大徑為6～16 cm。入院時已發(fā)生病理性骨折的13 例。Enneking III 期骨肉瘤15 例，Enneking II 期骨肉瘤33 例。病理類型均為普通型。術前均行1～2 療程的新輔助化療，化療方案為 AP-HDMTX-IFO 貫序化療。采用保肢手術 38 例，截肢術16 例。術后患者定期隨訪，分別于術后1 個月、3 個月、半年、1 年，之后每隔1 年隨訪1 次，記錄術后功能、腫瘤復發(fā)及轉移情況和生存時間。

二、蛋白檢測

采用免疫組織化學 SP 三步法進行免疫組化檢測。(1) 烤片：68 ℃，20 min；(2) 二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；(3)3% H2O237 ℃下孵育10 min，PBS 沖洗5 min×3 次以阻斷滅活內源性過氧化物酶；(4) 抗原修復：將切片置入 0.01 M 枸櫞酸緩沖液 ( pH6.0 ) 中，微波爐加熱至沸騰后斷電，自然冷卻20 min，再放入冷水中沖洗，加快冷卻至室溫，然后用 PBS 沖洗5 min×3 次；(5) 正常羊血清工作液封閉，室溫下放置10 min，倒去工作液勿沖洗；(6) 滴加1∶100 濃度稀釋好的 PrPc 一抗，4 ℃ 冰箱孵育過夜，PBS 沖洗5 min×3 次；滴加生物素標記的二抗，37 ℃ 孵育 30 min，PBS 沖洗5 min×3 次；(7) 滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃ 孵育 30 min，PBS 沖洗5 min×3 次；(8 ) DBA 顯色劑顯色5～10 min，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。實驗中用 PBS 代替一抗作為陰性對照。

三、結果判定及染色評分

采用已檢出的 PrPc 陽性片作為陽性對照，用PBS 代替一抗作為陰性對照，以排除假陽性結果。PrPc 陽性染色呈棕黃色，主要定位于細胞膜和細胞漿內。采用半定量計數(shù)法對染色結果評分，40×10高倍鏡下隨機取5 個視野，每個視野計數(shù) 100 個細胞，根據(jù)染色強度結合和每個視野中陽性細胞百分比綜合計分。染色強度：細胞無染色為 0 分；細胞膜、胞漿呈淡棕色為1 分；呈棕色者為2 分；深棕色為3 分。陽性細胞百分比 ≤10% 為 0 分；≤25%為1 分；≤50% 為2 分；≤75% 為3 分；＞75% 為4 分。然后將染色強度和陽性細胞百分比得分的乘積作為免疫組化染色結果進行評分分級：0 為陰性(-)，1～4 為弱陽性 ( + )，5～8 為中度陽性 ( ++ )，9～12 為強陽性 ( +++ )。

四、統(tǒng)計方法

結 果

朊蛋白 PrPc 在所有骨肉瘤標本中均表達，其陽性染色定位于細胞膜和胞漿內，呈棕黃色或深褐色顆粒 ( 圖1)。著色深度和細胞陽性率在不同的標本間存在差異 ( 圖2)。在瘤外組織內，PrPc 不表達( 圖3)。在15 例 Enneking III 期骨肉瘤中，標本染色評分為7.20±2.484；相對于對照組 33 例 Enneking II 期骨肉瘤中，標本染色評分為4.73±2.842，P＝0.006，兩者差異有統(tǒng)計學意義。χ2檢驗率的比較顯示實驗組和對照組之間在年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤體積、病理性骨折等方面差異無統(tǒng)計學意義( 表1)。用 Kaplan-Meier 法計算生存率并繪制生存曲線，Log-rank 單因素方差分析顯示，骨肉瘤患者預后生存率與性別、腫瘤部位、腫瘤大小以及是否病理性骨折無關 ( 表2)，與患者 PrPc 的表達水平( ＜5 分與≥5 分 ) ( 圖4) 及 Enneking 分期 ( 圖5) 相關。Cox 多因素分析顯示，PrPc 表達水平和腫瘤的Enneking 分期可以作為骨肉瘤預后的獨立影響因素( 表3)。

圖1 免疫組化顯示骨肉瘤組織中 PrPc 強陽性表達 (10×40 )圖2 免疫組化顯示骨肉瘤組織中 PrPc 弱陽性表達 (10×40 )圖3 在瘤外組織內 PrPc 呈陰性 (10×40 )Fig.1 The immunohistochemistry showed strongly positive expressions of PrPc in osteosarcoma (10×40 )Fig.2 The immunohistochemistry showed weakly positive expressions of PrPc in osteosarcoma (10×40 )Fig.3 The negative PrPc expressions in adjacent tissues (10×40 )

表1 實驗組和對照組在年齡、性別、腫瘤體積、病理性骨折等方面差異無統(tǒng)計學意義Tab.1 There were no statistically significant differences between the experimental group and the control group in the age, sex, tumor location, tumor size and pathologic fractures

圖4 Kaplan-Meier 生存曲線顯示， PrPc 高表達 ( ≥5 分 ) 骨肉瘤患者與低表達 ( ＜5 分 ) 生存率的差異Fig.4 The Kaplan-Meier survival curve showed the differences in the survival rate between high PrPc expressions in osteosarcoma ( ≥5 points ) and low PrPc expressions in osteosarcoma ( ＜5 points )

圖5 Kaplan-Meier 生存曲線顯示，Enneking III 期和 Enneking II期骨肉瘤生存率之間的差異Fig.5 The Kaplan-Meier survival curve showed the differences in the survival rate between the patients of Enneking III osteosarcoma and the patients of Enneking II osteosarcoma

討 論

骨肉瘤是源于間葉組織以能產生骨樣組織的梭形基質細胞為特征的惡性腫瘤，最常見于青少年。骨肉瘤的治療在骨腫瘤領域一直是個難題，隨著新輔助化療的規(guī)范應用，手術理念和技術的日益進步，雖然總體預后有了較大的提高，但那些已經(jīng)發(fā)生轉移的患者預后仍差。因此、人們逐漸把目光移向更接近腫瘤本質的基因靶向治療方面。根據(jù)腫瘤發(fā)生和轉移的多基因、多步驟學說，骨肉瘤發(fā)生和轉移的過程有多種基因參與其中，例如與細胞外基質侵襲性相關的 EGR1、Endothelin-1、CYR61 等，與免疫逃逸相關的 Fas、CD25 等，與靶器官捕獲和黏附相關的 CXCR-4、Ezrin 等，以及與新生血管生成相關的 VEGF、STAT3 等。這些不同階段基因的改變最終導致了骨肉瘤的發(fā)生和轉移。

表2 不同臨床特征與骨肉瘤預后生存率的關系Tab.2 The relationship between the different clinical features and the survival rate of the patients with osteosarcoma

表3 Cox 多因素模型回歸分析Tab.3 The multivariate Cox regression analysis model

朊病毒蛋白 PrPc 由 Prusiner 等[5]于 1982 年發(fā)現(xiàn)，人朊蛋白基因位于20 號染色體上，由兩段相互間隔的基因 PRNP，PRND 共同編碼的由 253 個氨基酸組成的蛋白質[6]。通常意義上人們認為 PrPc是人或動物海綿狀神經(jīng)變性性腦病，如克雅病的病原體，然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，PrPc 不僅在人類神經(jīng)系統(tǒng)中表達，在其它組織細胞中也可表達，如在胎盤、睪丸、肺上皮細胞、血液系統(tǒng)淋巴細胞、單核細胞、血小板、肝星形細胞等[7]。越來越多的研究表明，PrPc 與人類多種腫瘤的發(fā)生和轉移有關。其主要理論依據(jù)在于，人們發(fā)現(xiàn) PrPc 可以通過一系列瀑布式級聯(lián)反應以及不同的信號轉導通路來促進腫瘤細胞的抗凋亡、過度增殖、侵襲和藥物耐受性等特性[8]。

PrPc 可以通過不同的信號轉導途徑來導致癌癥的發(fā)生并促進其轉移，這一作用在一些人類實質性腫瘤中已得到初步證實。Meslin 等[9]用免疫組化方法檢測 756 例原發(fā)性乳腺癌 PrPc 的表達，發(fā)現(xiàn)PrPc 在腫瘤細胞中的陽性率為15% ( 113 / 756 )，且 PrPc 的過表達與乳腺癌輔助化療的耐藥性有關。Liang 等[10]發(fā)現(xiàn) PrPc 在胃癌組織標本中高表達，并且 PrPc 可以通過抑制 ROS 同時上調 Bcl-2 的表達來減緩癌細胞的凋亡。Du 等[11]通過 Northern blot和 PCR 發(fā)現(xiàn) PrPc 在阿霉素、長春新堿、順鉑、5-FU、環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺等多種化療藥物耐藥的胃癌細胞株 SGC7091 / ADR 中過表達相關，通過免疫組化檢測胃癌標本，其陽性率為 52.2% (12 /23 )，相對于癌旁組織 30.4% (7 /23 ) 有顯著性差異。Antonacopoulou 等[12]應用 rt-PCR 檢測 110 例結腸癌患者和 124 名正常人 PrPc 基因 PRNP 的表達，并用免疫組化法檢測 PrPc 在 68 結腸癌組織中的表達。發(fā)現(xiàn)結腸癌患者無論從基因水平還是蛋白水平，PrPc 的表達均高于對照組，且 PrPc 的表達水平與結腸癌的復發(fā)相關 ( P＝0.07 )。Diarra 等[13]在研究腫瘤細胞 TNF-α 耐藥性的主導基因時發(fā)現(xiàn)，PrPc在 TNF 抵抗的乳腺癌細胞株中，mRNA 表達水平是TNF 敏感性細胞株的17 倍。在蛋白水平，PrPc 在TNF 抵抗的乳腺癌組織的表達同樣高于對照。應用重組質粒轉染發(fā)現(xiàn)，高表達的 PrPc 可以將 TNF 敏感性細胞向 TNF 抵抗性細胞轉換。大量的基礎和臨床試驗證實，PrPc 在人類腫瘤的發(fā)生和轉移中起著重要作用。但究竟是朊蛋白的過表達直接導致癌癥的發(fā)生還是高表達的朊蛋白僅僅賦予了一些腫瘤細胞亞群特有的生存優(yōu)勢從而被條件選擇出來，仍然需要進一步探究。

迄今為止，有關 PrPc 與骨肉瘤的相互關系較少見諸報道[14]，尚無明確結論。在本實驗中，我們首先通過免疫組織化學方法檢測 PrPc 在 48 例骨肉瘤組織以及相應癌旁組織中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)PrPc 在普通型骨肉瘤組織中普遍表達，而在癌旁正常組織中未見表達，說明 PrPc 的高表達與骨肉瘤細胞的存在有關。PrPc 是一種膜蛋白，由核糖體合成，通過內質網(wǎng)折疊和高爾基體修飾轉運到達細胞膜，因此主要陽性染色位于細胞膜和胞漿內[15]。在比較不同轉移情況的骨肉瘤中 PrPc 表達水平時我們發(fā)現(xiàn)，有轉移的 Enneking III 期骨肉瘤和未轉移的Enneking II 期骨肉瘤之間表達水平存在差異，前者顯著高于后者，說明 PrPc 的高表達與骨肉瘤的轉移可能存在一定的相關性。但具體作用機制和信號轉導通路的發(fā)現(xiàn)尚需進一步深入研究。

關于 PrPc 的表達水平是否影響骨肉瘤預后，目前國內外尚無報道。我們通過 Kaplan-Meier 生存分析和 Log-rank 檢驗發(fā)現(xiàn)不同表達水平的骨肉瘤患者預后存在差異，PrPc 高表達 ( ≥5 分 ) 患者預后較低表達患者差 ( P＜0.05 )，這說明 PrPc 的表達水平與骨肉瘤的預后存在一定的關系。我們推斷，因為骨肉瘤一旦發(fā)生轉移，就預示著預后不良，發(fā)生肺轉移是導致骨肉瘤患者死亡的最主要原因，PrPc 的高表達與骨肉瘤轉移相關，這可能是 PrPc 影響骨肉瘤預后的潛在原因。

關于骨肉瘤的預后影響因素，無論是從臨床病理因素還是從分子生物學角度，國內外學者有不同的見解。Marcove 等[16]通過回顧性分析 145 例手術治療的骨肉瘤患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，僅年齡和腫瘤生長部位影響骨肉瘤肺轉移的出現(xiàn)時間，其它臨床因素并不影響5 年生存率。Bieling 等[17]認為骨肉瘤的預后與腫瘤體積有關，腫瘤體積較大的患者預后較差。Ozaki 等[18]認為骨肉瘤預后與生長部位有關，脊柱和胸肋骨的骨肉瘤預后較四肢骨肉瘤差。在生化方面，Wu 等[19]發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶 ( LDH ) 較高的患者，更容易發(fā)生轉移，因而預后較差。Ferrari等[20]發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶的水平對骨肉瘤的預后造成影響，堿性磷酸酶越高預后越差。還有學者認為人種差異和不同地區(qū)社會經(jīng)濟因素也會對骨肉瘤的生存預后造成一定影響[21]。當然，腫瘤的手術范圍，是否新輔助化療，以及腫瘤壞死率等預后影響因素已經(jīng)得到人們的廣泛認可。本研究通過比較本組48 例不同臨床特征與預后的關系，發(fā)現(xiàn)性別、年齡、腫瘤生長部位、腫瘤大小、病理性骨折等因素與預后生存率無關，而不同的 PrPc 的表達水平以及Enneking 分期與預后存在相關關系。這表明 PrPc 的表達水平可能作為骨肉瘤預后的獨立影響因素。但鑒于本試驗樣本量較少，隨訪時間不夠長 ( 最長隨訪7 年 )，尚需要更大樣本的多中心試驗來進一步驗證。

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( 本文編輯：王永剛 )

Expressions of cellular prion protein and the correlation analysis of prognosis in osteosarcoma of Enneking III

BAI Yun-peng, DONG Yang, ZHANG Zhi-chang, YANG Qing-cheng, XU Ze-quan, YAN Hong-liang. Department of Orthopedics, the sixth People’s Hospital Affliated to Shanghai Jiaotong University, 200233, PRC

ObjectiveTo investigate the expressions of cellular prion protein ( PrPc ) in Enneking III osteosarcoma and analyze its correlation with the metastasis and prognosis.MethodsImmunohistochemistry streptavidin-perosidase ( SP ) method was used to detect the expressions of PrPc in15 patients with osteosarcoma of Enneking III who had pulmonary metastases at the frst visit and in the corresponding adjacent tissues. By contrast, the same detection was performed on 33 patients with non-metastatic osteosarcoma at the first visit who were adopted during the same period. The expressions of PrPc between the2 groups were compared. The clinical data of the 48 patients with osteosarcoma were retrospectively reviewed, including the sex, age, tumor location, tumor size, pathologic fractures, survival time and so on. Their admission time ranged from January 2006 to December 2009. The Kaplan-Meier method was used to measure the overall survival rate. A log-rank univariate analysis was used to determine the prognostic factors related to the survival rate. The Cox multivariate analysis model was used to identify the independent prognostic factors. The relationship between the expressions of PrPc and different clinical features and the survival rate in the patients with osteosarcoma were explored.ResultsThe expressions of PrPc were noticed in the osteosarcoma tissues but not in the adjacent tissues. The expression level in the patients with Enneking III osteosarcoma was signifcantly higher than that in the control group ( P=0.006 ). The Kaplan-Meier survival analysis and Log-rank test showed that the PrPc expression level ( P=0.010 ) and the Enneking staging ( P=0.025 ) were related to the prognosis. The Cox regression analysis showed that the PrPc expression level and the Enneking staging were the prognostic factors of osteosarcoma patients.ConclusionsThe PrPc expressions are signifcantly higher in the patients with metastatic osteosarcoma of Enneking III than in the non-metastatic group. The higher PrPc expressions indicate apoor prognosis. The PrPc expressions may be associated with the poor prognosis of osteosarcoma.

Osteosarcoma; Gene expression; Prognosis; PrPc

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.07.008

R738.1

200233 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院骨科

董揚，Email: dongyang6405@163.com

2013-06-24 )