李 蘭，雷曉冬

（河南科技學(xué)院 生物工程系，河南 新鄉(xiāng) 453003）

淀粉酶活性常量與微量測(cè)定方法比較

李 蘭，雷曉冬

（河南科技學(xué)院 生物工程系，河南 新鄉(xiāng) 453003）

以實(shí)驗(yàn)室保存的淀粉酶產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)平板分離、點(diǎn)種、碘熏蒸，篩選出產(chǎn)淀粉酶活力較高的菌株。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)采用常量測(cè)定法和微量測(cè)定法對(duì)酶活性進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)定的酶活性差異不明顯，說(shuō)明微量測(cè)定法是可以代替常量測(cè)定法的。

枯草芽孢桿菌；淀粉酶；DNS；常量測(cè)定；微量測(cè)定

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類(lèi)的統(tǒng)稱(chēng)，能夠水解淀粉分子，生成包括糊精在內(nèi)的不同水解產(chǎn)物，并逐步生成由葡萄糖單位組成的聚合物。微生物的許多種類(lèi)都能產(chǎn)生淀粉酶，枯草芽孢桿菌是其中主要生產(chǎn)菌種之一。淀粉酶是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種。特別是20世紀(jì)60年代以來(lái)，由于酶法生產(chǎn)葡萄糖以及用葡萄糖生產(chǎn)異構(gòu)糖漿的大規(guī)模工業(yè)化，淀粉酶的需要量越來(lái)越大，幾乎占到整個(gè)酶制劑總產(chǎn)量的50%。目前淀粉酶被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，因此，做好淀粉酶活性測(cè)定工作具有重要意義。

測(cè)定α-淀粉酶活性的方法有分光光度法、應(yīng)交擴(kuò)散法、3，5-二硝基水楊酸法、黏度計(jì)法和降落值法。目前，3，5-二硝基水楊酸法是最常用的方法。在大多數(shù)測(cè)定淀粉酶的實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)中，都是采用常規(guī)的方法和步驟，試劑用量較大，且操作過(guò)程不夠簡(jiǎn)便。本實(shí)驗(yàn)選用的產(chǎn)淀粉酶菌株是實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌，經(jīng)過(guò)平板分離、點(diǎn)種、碘熏蒸，篩選出淀粉產(chǎn)酶活性較高的菌株；通過(guò)常量和微量?jī)煞N方法分別測(cè)定淀粉酶活性，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，希望可以提供一種能夠代替常量測(cè)定的經(jīng)濟(jì)、有效、簡(jiǎn)便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株

實(shí)驗(yàn)室試管保存的枯草芽孢桿菌。

1.1.2 試劑

檸檬酸緩沖液（pH 6.0），0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，1%淀粉溶液，3，5-二硝基水楊酸（DNS），標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1 g/L）。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏0.2%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH 6.5。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏1%，蛋白胨1.5%，酵母膏0.2%，氯化鈉0.5%，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉5%，牛肉膏1%，蛋白胨1.5%，酵母膏0.2%，氯化鈉0.5%，氯化鈣1%，pH 6.5。

1.1.4 儀器

722N可見(jiàn)分光光度計(jì)，101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱，恒溫水浴鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，YPW-Ⅰ型迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，80-1離心沉淀器，凈化工作臺(tái)，JA5002電子天平，蒸汽消毒器，電爐，電磁爐等實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的篩選及保存

1.2.1.1 菌種的篩選

將試管保存的制備枯草芽孢桿菌成菌懸液，分別稀釋10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7倍，

各取1 mL涂布于平面上，分別置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。在濃度適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上選取15個(gè)菌株，分別編號(hào)，轉(zhuǎn)接于試管斜面，于37℃下培養(yǎng)24 h，置冰箱保存。然后用接種針?lè)謩e蘸取每個(gè)菌落點(diǎn)種在已經(jīng)滅過(guò)菌的平板上，37℃下培養(yǎng)24 h。用碘熏蒸培養(yǎng)皿，在菌落周?chē)霈F(xiàn)水解圈，測(cè)量水解圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（HC比值），作為篩選指標(biāo)。

1.2.1.2 菌種的保存

選取酶活性較高的菌株，將冰箱中保存的相應(yīng)菌株接種于20支試管斜面上，37℃下培養(yǎng)24 h，然后保存在4℃冰箱中。

1.2.2 淀粉酶活性的常量、微量測(cè)定

1.2.2.1 粗酶液制備

從冰箱中取出保存的菌株，轉(zhuǎn)接試管斜面活化，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h。將菌種挑取三環(huán)接種到30/250 mL種子培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min，培養(yǎng)12 h。用移液管吸取3 mL接種到30/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min，培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵液3500 r/min離心10min，去上清液，即為粗酶液。

1.2.2.2 酶促反應(yīng)

每一個(gè)樣品4支試管，一個(gè)做對(duì)照，其他用于測(cè)定樣品（3個(gè)平行樣）；每管加入酶液1 mL，向各管中加入檸檬酸緩沖液（pH 6.0）1 mL，然后再向?qū)φ展苤屑尤?.4 mol/L氫氧化鈉溶液，以終止其中的酶促反應(yīng)，各管均是在60℃水浴15 min；分別向各試管中加入60℃水浴預(yù)熱15 min的1%淀粉溶液，搖勻，立即放回水浴中，準(zhǔn)確保溫10 min；迅速向各測(cè)定管中加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，以終止酶促反應(yīng)。每一步加入試劑的用量見(jiàn)表1。

表1 常量和微量酶促反應(yīng)的試劑用量對(duì)比

1.2.2.3 顯色反應(yīng)

待測(cè)樣：取上述酶促反應(yīng)液于試管中，加入3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5 min。取出冷卻，蒸餾水稀釋。利用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定520 nm下的吸光度。其中，常量試劑中，酶促反應(yīng)液和DNS各2.0 mL，稀釋至24 mL；微量試驗(yàn)中，2種試液分別加入0.5 mL，稀釋至6 mL；標(biāo)準(zhǔn)液：取7支試管，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 g·L－1），再向各試管中加水定容。然后加入3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5 min。取出冷卻，蒸餾水稀釋。利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定520 nm下的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)樣常量和微量顯色反應(yīng)的實(shí)際用量見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)樣常量和微量顯色反應(yīng)的實(shí)際用量對(duì)比

1.2.2.4 樣品中葡萄糖含量的計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)樣中葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程。將待測(cè)樣的吸光度代入方程，求得待測(cè)樣的葡萄糖含量，折算成1 mL粗酶液中葡萄糖的含量及酶活力。淀粉酶活力＝濃度×體積×1000×稀釋倍數(shù)/時(shí)間。其中，濃度單位為g/L，酶活力單位為μg/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的篩選結(jié)果

篩選了5株產(chǎn)酶活性較高的菌株，分別為枯草6，枯草8，枯草11，枯草13，枯草14，其水解圈直徑（H）與菌落直徑（C）比值見(jiàn)表3。

表3 5株枯草芽孢桿菌菌落水解圈直徑與菌落直徑比值

由表3可以看出，枯草13菌株形成的比值最大，產(chǎn)酶活力較高，因此選定枯草13作為篩選結(jié)果。

2.2 淀粉酶活性常量和微量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在常量和微量方法中的對(duì)比

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行顯色反應(yīng)，常量測(cè)定法和微量測(cè)定法所測(cè)的吸光值及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)試驗(yàn)方法規(guī)定，R2相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99的回歸方程才可使用。從表4可以看出，采用常量和微量試驗(yàn)方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。說(shuō)明采用微量法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是可以利用的。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的常量和微量對(duì)比

2.2.2 采用常量和微量法測(cè)定待測(cè)樣品結(jié)果對(duì)比

常量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程：

y＝1.416x－0.054（R2相關(guān)系數(shù)為0.999）

微量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程：

y＝1.374x－0.054（R2相關(guān)系數(shù)為0.999）

以每個(gè)樣品3次重復(fù)為樣品，做3個(gè)平行。對(duì)其進(jìn)行淀粉酶活性測(cè)定。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

常量、微量法測(cè)定的酶活力比較見(jiàn)表7。

由表7無(wú)法確定測(cè)定方法的差異，因此對(duì)兩種方法所測(cè)酶活力進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表8。

表5 待測(cè)樣在常量試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)分析

表6 待測(cè)樣在微量試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)分析

表7 常量、微量法測(cè)定酶活力的比較

表8 常量、微量法測(cè)定酶活力結(jié)果方差分析

由表8可以看出，F(xiàn)＝0.77＜F0.05＝4.49，說(shuō)明兩種測(cè)定方法之間不存在明顯差異，同時(shí)也可以判定這種差異是由實(shí)驗(yàn)誤差引起的，不存在本質(zhì)差異。因此，微量方法是可以代替常量方法進(jìn)行淀粉酶活力測(cè)定的。

3 小結(jié)

從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，微量測(cè)定法和常量測(cè)定法存在差異，但是差異不顯著，因此可以用微量測(cè)定法代替常量測(cè)定法對(duì)淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定，從而節(jié)約藥品用量，降低測(cè)定成本。

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［責(zé)任編輯：鄧 渝］

Com parison between the M ethods for Constant M easurement and M icro Determ ination of Am ylase Activity

LILan，LEIXiao-dong
（Department of Bioengineering，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

The bacterium bacillus subtiliswhich was produced from amylase and kept in the laboratory was treated as the starting strain.The strain with higher production of amylase was screened through the flat panel separation，dibbling and iodide fumigation.This experiment used the constants determination and the micro determination to determine the amylase activity and the data was analyzed by comparative analysis.The result showed that the difference of two methods for the determination of enzyme activity was not apparent，which proved that micro determination method could replaced the constant determination method.

bacillus subtilis；amylase；DNS；constantmeasurement；micro determination

Q946.5

A

1006－8481（2014）04－0033－05

2014－05－06

李蘭（1972—），女，河南科技學(xué)院生物工程系高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。