查悅明， 陀韋為， 王 卓， 張剛平， 黃耀熊

(暨南大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系, 廣東 廣州 510632)

0 引 言

在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中往往需要分析大量的圖片，僅僅依靠人眼觀察比較，只能獲得粗略的定性的理解，若要獲得定量的數(shù)據(jù)或?qū)D像進(jìn)行增強(qiáng)改善，則需要借助圖像處理與分析軟件?，F(xiàn)在一般通用的圖像處理分析軟件功能比較單一，針對(duì)性不強(qiáng)，智能化自動(dòng)化程度低，很多操作需要手動(dòng)完成，造成人為誤差，檢測不準(zhǔn)確，且耗時(shí)費(fèi)力[1-2]。在實(shí)際使用中，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件不同，圖像千差萬別，通用的圖像處理分析軟件作用很有限。這就需要我們針對(duì)特定的實(shí)驗(yàn)圖像與檢測要求設(shè)計(jì)軟件，傳統(tǒng)的編程語言系統(tǒng)編寫程序工作量大，需要時(shí)間長[3-4]，對(duì)于編寫只針對(duì)某一兩種實(shí)驗(yàn)使用的軟件十分不劃算。而Vision Builder AI(VBAI)則是NI公司推出的快速生成視覺自動(dòng)檢測生成器，用戶基本無需編程，就可以在數(shù)小時(shí)甚至幾分鐘內(nèi)建立好自己的檢測程序[5-6]，從而對(duì)圖像進(jìn)行自動(dòng)的，大批量的，客觀的，準(zhǔn)確的檢測，并自動(dòng)計(jì)算、保存、輸出結(jié)果，十分適合在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中使用。

1 應(yīng)用于微球內(nèi)外徑等尺度指標(biāo)的自動(dòng)測定

1.1 背 景

微球作為載體、傳感器等在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛[7-8]，在實(shí)驗(yàn)中通常需要對(duì)微球進(jìn)行檢測和分析，分析的指標(biāo)主要有半徑[9]、圓度、折射率等等。利用基于VBAI的顯微圖像分析是比較方便的方式。

1.2 方法

將微球投入溶液中，使其分布較均勻，并置于顯微鏡下觀察，得到清晰的微球顯微圖像。根據(jù)我們先前的工作，通過測定微球的外徑D以及其在溶液中所成像的黑環(huán)內(nèi)徑的d，可以根據(jù)有關(guān)理論方程來確定微球或其周邊介質(zhì)的折射率[10]。因此，需要精確測定D與d。下面介紹我們用VBAI編寫的程序如何實(shí)現(xiàn)對(duì)微球像D與d的智能自動(dòng)測定。

圖1 微球顯微圖像

利用VBAI設(shè)計(jì)檢測的程序流程如圖2所示。

進(jìn)入VBAI的Inspection State編輯窗口，可以編輯整個(gè)程序的主要過程，如圖3所示。我們的設(shè)計(jì)是：先在“Inspect”過程中對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理并找到物體，得到物體個(gè)數(shù)；然后在“GO ON?”過程中判斷檢測到幾個(gè)物體，是否已經(jīng)檢測完全部物體；隨后在“Measure”過程中對(duì)當(dāng)前序號(hào)的物體進(jìn)行檢測。

進(jìn)入每個(gè)過程進(jìn)行具體步驟的編輯，只需雙擊右側(cè)工具中的相應(yīng)操作，就可以將該操作加入程序中，在屬性窗口中對(duì)操作的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定。在“Inspection”過程中，我們首先打開圖片，選中循環(huán)取圖將依次獲取目標(biāo)文件夾中的每個(gè)圖像文件。如要測量真實(shí)尺寸，則要對(duì)圖像進(jìn)行標(biāo)定，VBAI中Calibrate image有多種方式，如圖4所示。通常實(shí)驗(yàn)室顯微鏡采用顯微標(biāo)尺進(jìn)行標(biāo)定，選擇第一種模式，導(dǎo)入顯微標(biāo)尺的圖像，標(biāo)定完成后生成標(biāo)定文件，檢測時(shí)自動(dòng)讀取。接著我們對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理，這將打開vision assistant窗口，可對(duì)圖像進(jìn)行LUT變換、濾波、分割、形態(tài)學(xué)變換等多項(xiàng)操作，在本實(shí)例中將圖像處理為適合尋找物體的二值化圖像。然后對(duì)處理過的二值化圖片進(jìn)行Detect Objects操作，得到物體數(shù)列。Select Image操作將原圖像讀入，代替處理過的二值化圖像，為下一步檢測做準(zhǔn)備。Set Variable的操作是將Detect Objects操作中檢測到的物體個(gè)數(shù)存入代表剩余物體數(shù)的X。

圖3 Inspection State編輯窗口

圖4 Calibration選項(xiàng)

“GO ON?”過程中沒有圖像處理的具體操作，只在Inspection State編輯中有一個(gè)判斷，在指向end的箭頭定出編輯走向end的條件，為剩余物體數(shù)X<1，當(dāng)X≥1時(shí)將執(zhí)行默認(rèn)箭頭，走向“Measure”過程。如圖5所示。

“Measure”過程中，首先Index Measurements讀取之前Detect Objects中檢測得到的物體數(shù)列的的第X個(gè)物體。接著，要設(shè)置程序可以根據(jù)物體的位置、大小等自動(dòng)建立相應(yīng)的ROI，即檢測區(qū)域，由于要進(jìn)行微球圖像直徑的檢測，因此區(qū)域類型選擇圓環(huán)形。

圖5 Measure過程

然后就可以在檢測區(qū)域內(nèi)進(jìn)行圓的直徑檢測了，利用Find Circular Edge操作可以很方便地做到這一點(diǎn)。其參數(shù)設(shè)置界面如圖6所示。

圖6 Find Circular Edge選項(xiàng)

在直徑檢測中，程序在檢測區(qū)域內(nèi)沿徑向生成一系列的檢測線，圖5中下方的曲線為沿檢測線方向上灰度值變化曲線的一次導(dǎo)數(shù)曲線，反映了灰度值的變化速率，負(fù)數(shù)部分對(duì)應(yīng)圖像由亮變暗，正數(shù)部分對(duì)應(yīng)圖像由暗變亮，極值處即變化速率最快處，也就是邊緣所在位置。曲線上方的參數(shù)設(shè)定包括判斷邊緣的閾值，平滑算子的大小，取樣寬度，每條檢測線之間的間隔等。由于是根據(jù)擬合出的曲線確定邊緣位置，因此可以超越像素的限制，實(shí)現(xiàn)亞像素等級(jí)的超分辨率精確度。檢測程序首先得到每條檢測線上的邊緣點(diǎn)位置，再根據(jù)所有邊緣點(diǎn)擬合出圓形邊界，計(jì)算出直徑數(shù)值，程序中給出精確到0.01個(gè)像素的結(jié)果。結(jié)果的穩(wěn)定性還要取決于拍攝環(huán)境、光照、相機(jī)穩(wěn)定性等。圖像中微球邊緣的黑環(huán)是由于光線折射造成的，根據(jù)我們先前工作[10]，證明其粗細(xì)與微球與溶液的折射率比值成一定比例關(guān)系。因此，程序中通過分別測量各微球的D與d，調(diào)整Find Circular Edge操作中搜尋方向、邊緣種類等參數(shù)可以搜尋到內(nèi)徑圓和外徑圓。在精確測定D與d值后，可自動(dòng)根據(jù)我們先前工作導(dǎo)出的方程式[10]，給出微球的折射率或是其周邊介質(zhì)的折射率。

Calculator是界面類似LabVIEW圖像化編程工具的一項(xiàng)功能，可以由用戶自己選擇輸入輸出量、制定復(fù)雜的運(yùn)算程序等，本實(shí)例中為利用文獻(xiàn)[10]的方程式計(jì)算出微球的折射率。Data Logging可以選擇需要記錄的數(shù)據(jù)寫入指定的txt或csv文件，以便后續(xù)的數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。最后Set Variable將變量X減1。

VBAI應(yīng)用編寫完成后可作為專用的檢測軟件使用，處理圖片時(shí)將需要分析的圖像放在同一目錄下，進(jìn)入VBAI文件，指定該路徑，點(diǎn)擊Run Inspection in Loop，就可以自動(dòng)完成所以圖片的分析，并得到記錄有數(shù)據(jù)的txt或csv文件。

這樣生成的檢測程序智能、客觀、準(zhǔn)確、快速，實(shí)現(xiàn)了圖像中微球的識(shí)別尋位、移動(dòng)ROI建立、兩個(gè)直徑的測量、折射率計(jì)算、數(shù)據(jù)保存等操作的完全自動(dòng)化運(yùn)行。而且整個(gè)操作與運(yùn)算排除了人為操作中的主觀性因素，精度亦達(dá)到亞像素水平，平均單個(gè)微球的測量時(shí)間僅需0.20 s。

為了檢驗(yàn)其測定的準(zhǔn)確性，在對(duì)拍攝系統(tǒng)和環(huán)境進(jìn)行標(biāo)定和控制之后，選擇合適的微球作為檢測對(duì)象進(jìn)行多次檢測，其檢測結(jié)果如表1所示。同時(shí)，用以往常用的油浸法[11]對(duì)微球折射率作對(duì)照測定，測得的折射率與本VBAI生成系統(tǒng)測定結(jié)果高度吻合，說明VBAI檢測程序的測量準(zhǔn)確性可重復(fù)性較高。

表1 微球折射率檢測結(jié)果 溫度：20℃ 水折射率：1.333 0

油浸法測得微球折射率：1.462 0±0.000 5

2 應(yīng)用于細(xì)胞檢測

2.1 背 景

細(xì)胞是生物醫(yī)學(xué)研究的重要對(duì)象之一，通過分析細(xì)胞的顯微圖像我們可以得到很多有用的信息。紅細(xì)胞是人類血液中存在的主要細(xì)胞，一直是研究的熱點(diǎn)。正常的紅細(xì)胞呈雙凹圓盤狀，而衰老和不健康的紅細(xì)胞會(huì)呈棘形、雙凹消失等不規(guī)則的形態(tài)[12]。通過觀察與分析顯微圖像中紅細(xì)胞的形態(tài)可以評(píng)價(jià)其健康程度[13-14]。所以這里以紅細(xì)胞為例說明如何采用VBAI編寫適合于進(jìn)行細(xì)胞圖像分析的技術(shù)過程。

2.2 方 法

將紅細(xì)胞懸浮于緩沖液中，置于顯微鏡下觀察，利用數(shù)碼CCD攝像頭拍攝下細(xì)胞的圖像，如圖7-a所示。

檢測程序上需要先尋找到各個(gè)細(xì)胞，再對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測，與微球檢測的過程類似，程序總體設(shè)計(jì)上依然可以利用上節(jié)中微球的檢測程序的設(shè)計(jì)，但需要根據(jù)有關(guān)圖像處理分析的內(nèi)容更改具體的圖像處理分析操作。

(a)原圖像(b)處理后的圖像

圖7 紅細(xì)胞圖像處理前后

在圖像預(yù)處理操作中需要將原始圖像處理為適合物體識(shí)別的二值化圖像，利用Vision Assistant，先對(duì)圖像轉(zhuǎn)灰度圖像、適當(dāng)?shù)腖UT處理，在分割處理上，由于細(xì)胞邊緣處明暗對(duì)比較大，邊緣銳利，因此選用基于移動(dòng)窗口分割的算法可以較容易地找到邊緣。通過實(shí)驗(yàn)比較證明，選用Background correction分割，可綜合局部和全局的灰度變化信息。分割移動(dòng)窗口大小設(shè)置為邊長接近細(xì)胞邊緣寬度2倍的正方形最為合適。分割完成后再對(duì)二值圖像進(jìn)行一定的形態(tài)學(xué)變換操作，將邊緣盡量變得閉合并填充孔洞。最后進(jìn)行Detect Objects操作，得到圖7(b)所示的圖像。

接著將對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析。首先根據(jù)Detect Objects操作中所檢測到的物體列表，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測區(qū)域的建立，即設(shè)置ROI。然后依然使用Find Circular Edge操作，在該操作中調(diào)整參數(shù)，使得檢測線能較準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)邊緣。該操作完成后，將輸出一項(xiàng)名為Deviation的參數(shù)，該參數(shù)代表了細(xì)胞邊緣與標(biāo)準(zhǔn)圓的標(biāo)準(zhǔn)偏差。同時(shí)該操作還可以得到細(xì)胞直徑等相關(guān)的信息。將Deviation除以直徑后可以得到細(xì)胞邊緣與標(biāo)準(zhǔn)圓的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，由于健康紅細(xì)胞的圖像是近似圓形的，因此Deviation參數(shù)可以一定程度上反映紅細(xì)胞的健康程度。

將實(shí)驗(yàn)中拍攝到的采用不同保存格式、保存不同天數(shù)的紅細(xì)胞圖片歸類，用VBAI程序進(jìn)行分析，結(jié)果保存在csv文件中。

如圖8(a)所示為較健康的細(xì)胞，圖像中細(xì)胞外輪廓近似圓形，Deviation/R=1.2‰；圖8(b)所示為發(fā)生了一定形變的細(xì)胞，Deviation/R=3.2‰；圖8(c)所示為嚴(yán)重變形的棘形細(xì)胞，Deviation/R=7.3‰。隨著細(xì)胞變形程度加重，細(xì)胞的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值也隨之增加。

(a) Deviation/R=0.12%

(b) Deviation/R=0.32%

(c) Deviation/R=0.73%

圖8 不同形態(tài)紅細(xì)胞及其Deviation/R的值

通過軟件分析的優(yōu)勢在于：可以客觀而定量地給出每個(gè)細(xì)胞的變形程度；可以快速自動(dòng)地分析大量的圖片，得到大量的數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)處理，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除此之外，還可以獲得細(xì)胞的大小信息，通過視野內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)，得到細(xì)胞分布密度信息等。

3 應(yīng)用于圖像的改善

3.1 背景

某些生物醫(yī)學(xué)樣品的顯微圖像，由于各種原因，其清晰度與對(duì)比度都不能滿意[15]，對(duì)此，也可以運(yùn)用VBAI的圖像處理的方式對(duì)圖像進(jìn)行改善。下面介紹花粉孢子斷層掃描圖像中噪音及對(duì)比度不理想的斷層圖作改善的技術(shù)過程。

3.2 方法

首先對(duì)整幅圖像中的噪雜進(jìn)行去除，通常改善的方法有空域?yàn)V波和頻域?yàn)V波，兩種方法都可通過Vision Assistant中的算法實(shí)現(xiàn)。其中空域?yàn)V波的算子較多，功能更加豐富，其設(shè)置頁面如圖9所示。不僅提供了低通、高通等10多種算子、每種算子3×3，5×5，7×7三種尺寸，還可以由用戶自定義算子以滿足特殊需要。圖10所示為原圖像、使用Local Average算子和使用自定義算子處理后的圖像。

整幅圖像改善完成后對(duì)左右對(duì)比度及清晰度不理想的花粉孢子斷層圖像進(jìn)行增強(qiáng)，首先建立一覆蓋圖11(a)中央花粉孢子像的區(qū)域，使用一可旋轉(zhuǎn)的長方形區(qū)域，長方形的方向與左右像平移的方向垂直，寬度等于左右像平移的距離。

圖9 Filters設(shè)置界面

(a) 原圖像

(b) Local Average算子

(c) 自定義算子

(a) 增強(qiáng)前的圖像

(b) 左右斷層圖像增強(qiáng)后的圖像

接著利用Calculator操作計(jì)算圖11(a)左右像的位置。輸入中央像的中心點(diǎn)(X0,Y0)、角度α和平移距離L，則左像、右像中心點(diǎn)(X1,Y1)，(X2,Y2)分別為：

以此為中心點(diǎn)坐標(biāo)參數(shù)，長寬與角度參數(shù)使用中央?yún)^(qū)域的長寬與角度，分別建立覆蓋左右像的區(qū)域，使用Vision Assistant對(duì)左右區(qū)域內(nèi)的圖像進(jìn)行對(duì)比度、明暗度的調(diào)整增強(qiáng)，如圖12所示。

得到處理后的圖像，三個(gè)層面的圖像的對(duì)比度基本相同，結(jié)果如圖11(b)所示。

利用VBAI對(duì)圖像進(jìn)行處理與改善，不僅功能豐富，適用性強(qiáng)，且操作簡單，易于掌握，程序建立完成后還可以快速的對(duì)其他同類圖片進(jìn)行處理，大大節(jié)省了時(shí)間。

圖12 明暗及對(duì)比度調(diào)整界面

4 結(jié) 語

使用VBAI創(chuàng)建圖像分析處理程序，可對(duì)各種生物醫(yī)學(xué)對(duì)象進(jìn)行分析和檢測，可對(duì)圖像進(jìn)行處理與改善，其優(yōu)勢在于：

(1) 相比起人眼觀測和手動(dòng)測量，本方法能夠提供客觀和量化的數(shù)據(jù)，可快速對(duì)大量圖像進(jìn)行自動(dòng)分析并保存檢測結(jié)果。

(2) 相比起通用化的測量分析軟件，本方法針對(duì)性強(qiáng)，針對(duì)各種特定情況和需要制定適應(yīng)的程序，準(zhǔn)確性、有效性和實(shí)用性高。

(3) 相比起使用VC等編程軟件編寫特定測量分析軟件，本方法簡單，有大量強(qiáng)大的模塊化功能自由選用，程序開發(fā)周期短，工作量小，不需要專業(yè)編程技能，一般人易于掌握，且程序易于調(diào)整改進(jìn)。

綜上所述，使用VBAI可簡單快捷的針對(duì)不同生物醫(yī)學(xué)圖像建立相應(yīng)檢測處理程序，可快速自動(dòng)地對(duì)大量圖像進(jìn)行分析，得到客觀量化的數(shù)據(jù)。VBAI是實(shí)驗(yàn)室快速建立生物醫(yī)學(xué)圖像處理與分析檢測程序的有力工具。

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·名人名言·

如果你問一個(gè)善于溜冰的人怎樣獲得成功時(shí)，他會(huì)告訴你：“跌倒了，爬起來?！边@就是成功。

——牛頓