金黎明，劉李娜，許永斌，張麗影，鄭 維，范圣第

(1.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116605;2.海軍醫(yī)學研究所，上海 200443)

黨參(Codonopsis pilosula)是中國傳統(tǒng)補益藥，其味甘性平，有補中益氣、健脾生津之功效。其中黨參多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide，CPP)系其主要有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、降低膽固醇、降血脂、增強免疫調(diào)節(jié)功能、促進細胞增殖和骨細胞生長、保護肝腎等器官損傷以及治療慢性蕁麻疹、糖尿病等多種功效［1］。

硒(selenium)是人體所必需的微量元素之一，具有抗氧化、延緩衰老、抗癌、增強人體免疫力等功效。但大多數(shù)無機硒化合物毒性較大，應用受到極大的限制。硒多糖作為一種有機硒化合物，比無機硒安全，且兼有硒與多糖二者的優(yōu)點，更加易于機體的吸收和利用［2］。目前已有許多研究證明，硒多糖具有抗金屬中毒、抗氧化、抗癌細胞及抗病毒等多種作用［3－4］。

有些動植物和微生物體內(nèi)含有天然硒多糖，但是含量很少，使得硒多糖的研究受到了一定限制。近年來，研究者嘗試使用人工方法獲得硒多糖，如在合適的培養(yǎng)條件下把無機硒添加到藻類、真菌等培養(yǎng)基中，通過生物體自身富集和轉(zhuǎn)化來獲得硒多糖［5－6］。此外，也可以利用化學合成方法獲得硒多糖。如硒化角叉菜膠［7］、硒化紅薯葉多糖［8］、硒化枸杞多糖［9］、硒化白沙蒿多糖［10］、硒化羧甲基殼聚糖［11］等多種富硒產(chǎn)品［12］，但是尚未見硒化黨參多糖的報道。

本實驗以亞硒酸鈉和黨參多糖為原料合成硒化黨參多糖(selenium－Codonopsis pilosula polysaccharide，SeCPP)，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP－MS)法測定其中硒含量，利用紫外－可見光譜、紅外光譜兩種方法對其進行表征，并采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法測定SeCPP的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

儀器:7700X Series型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);Lambda25型紫外－可見分光光度計(美國PE公司);370DTGS型紅外光譜儀(美國Thermo公司);DF－101S型恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪于華儀器廠);DHG－9070A型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);Seven Easy型pH計(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)。

試劑:黨參提取物(西安天一生物技術(shù)有限公司);亞硒酸鈉、無水乙醇、冰乙酸、鹽酸、硝酸、甲苯、濃硝酸、雙氧水、鄰苯三酚、鄰二氮菲、抗壞血酸(Vc)等，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 黨參多糖的純化

稱取10 g黨參多糖提取物，加入100 mL蒸餾水將其溶解，加入20%體積的正丁醇－氯仿混合液(體積比為1∶5)，劇烈振蕩20 min。4 000 r·min－1離心10 min，傾出上清液，除去中間層變性蛋白和下層氯仿。重復以上操作，直至中間層無變性蛋白。向上清液中加入3倍體積的無水乙醇，冰箱冷藏過夜，得到多糖沉淀，冷凍干燥得到純化的CPP。

1.2.2 黨參多糖中多糖含量測定

用苯酚－硫酸法測定CPP中多糖含量［13］。

1.2.3 硒化黨參多糖的制備

參考梁淑軒［9］的方法，稱取1 g純化后的CPP溶解于25 mL超純水中，磁力攪拌溶解后加入1 mL冰醋酸。取1 g亞硒酸鈉溶于少量超純水，緩慢加入上述CPP溶液中，加熱至50℃，攪拌下反應48 h。反應畢，加入3倍體積無水乙醇，使其沉淀完全。離心得到沉淀后用無水乙醇洗滌3次，加入少量的超純水溶解，用超純水透析24 h，未透液經(jīng)冷凍干燥得到SeCPP。

1.2.4 紫外光譜法測定

將CPP和SeCPP用去離子水配成0.5 mg·mL－1的溶液，用去離子水為參比，進行紫外光譜測定，波長掃描范圍為190～400 nm。

1.2.5 紅外光譜法測定

將少量的CPP和SeCPP用KBr壓片，進行紅外吸收光譜測定，測定范圍為400～4 000 cm－1。

1.2.6 電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP－MS)法測定硒含量

準確稱取適量SeCPP于干燥的聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入4 mL硝酸及1 mL H2O2搖勻，密封，置入微波消解系統(tǒng)中進行消解，消解完全后，用少量超純水洗罐3～4次，定容。用ICP－MS測定，樣品定量分析采用外標法，內(nèi)標元素選用89Y。分別做3次平行實驗，取平均值。根據(jù)標準曲線計算硒含量。儀器工作參數(shù)見表1。

表1 Agilent 7700X Series ICP－MS工作參數(shù)

1.2.7 抗氧化能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定CPP和SeCPP清除超氧陰離子自由基的能力，以Vc為對照實驗［14］。

采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法測定CPP和SeCPP清除羥自由基的能力，以Vc為對照實驗［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 黨參多糖中多糖含量測定

葡萄糖標準曲線如圖1，由此計算得出純化后的CPP中多糖質(zhì)量分數(shù)為78.95%。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 硒化黨參多糖的制備及硒含量測定

得到的SeCPP為深棕色固體粉末，產(chǎn)率為43.65%。經(jīng)ICP－MS測定其中硒的質(zhì)量分數(shù)為25.92 mg·g－1。

目前化學法合成硒化多糖常用SeOCl2、亞硒酸、亞硒酸鈉等作為硒化試劑。Wang等［10］用H2SeO3/HNO3和BaCl2作催化劑，合成了硒化白沙蒿多糖，發(fā)現(xiàn)強酸會使多糖降解。本實驗參考了梁淑軒等［9］的方法，以醋酸作為催化劑，操作簡單、安全，并綜合考慮制備成本及操作的簡便性，確定反應溫度為50℃，反應時間為48 h。制備得到的SeCPP中硒的質(zhì)量分數(shù)為25.92 mg·g－1，高于某些文獻報道的結(jié)果，如合成的硒化紅薯葉多糖中硒的質(zhì)量分數(shù)為 358 μg·g－1［8］、合成的硒化白沙蒿多糖中硒的質(zhì)量分數(shù)為 1 703 μg·g－1［10］、合成的硒化羧甲基殼聚糖中硒的質(zhì)量分數(shù)為20.50 mg·g－1［11］。

目前測定硒含量的方法有ICP－MS法、比色法、原子吸收光譜法、氣相色譜法及熒光分光光度法等，其中ICP－MS法因具有測定快速、靈敏度高、準確性好等特點被公認為是較好的方法［15］。本文使用ICP－MS法測定硒含量，結(jié)果準確可靠。

2.3 紫外圖譜

黨參多糖和硒化黨參多糖的紫外吸收光譜圖如圖2。

圖2 黨參多糖和硒化黨參多糖的紫外吸收光譜圖

從圖2中可以看出，CPP經(jīng)硒化后，最大吸收峰從277 nm紅移到279 nm，同時，225 nm處的吸收峰消失。峰值的變化表明CPP結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，由此推測CPP中成功地引入了亞硒酸根。

2.4 紅外圖譜

黨參多糖和硒化黨參多糖的紅外光譜圖如圖3。

圖3 黨參多糖和硒化黨參多糖的紅外光譜圖

由圖3可知，經(jīng)硒化后的CPP紅外圖譜變化不大，說明多糖的結(jié)構(gòu)基本沒有改變。硒化后，在802 cm－1處出現(xiàn)有亞硒酸酯的特征吸收峰。CPP的C6－OH的伸縮振動峰由1 027 cm－1紅移至1 022 cm－1，說明C6上的－OH可能參與了硒化反應，形成－SeH結(jié)構(gòu)。

2.5 對超氧陰離子自由基的清除作用

黨參多糖和硒化黨參多糖對超氧陰離子自由基的清除率曲線如圖4。

圖4 黨參多糖和硒化黨參多糖對超氧陰離子自由基的清除率曲線

從圖4可以看出，在實驗設置的濃度范圍內(nèi)，CPP和SeCPP對超氧陰離子自由基均有不同程度的清除作用。結(jié)果表明，CPP和SeCPP對超氧陰離子自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強，且SeCPP的清除作用強于CPP。質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL－1的CPP和SeCPP對超氧陰離子的清除率分別為47.05%和54.46%。

2.6 對羥自由基的清除作用

黨參多糖和硒化黨參多糖對羥自由基的清除率曲線如圖5。

圖5 Vc對超氧陰離子自由基的清除率曲線

從圖5可以看出，CPP和SeCPP對·OH均有一定的清除作用。結(jié)果表明，清除作用與質(zhì)量濃度成正比，且SeCPP的清除能力更強。質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL－1的 CPP 和 SeCPP，對·OH 的清除率分別達到了50.20%和61.75%。

3 結(jié)論

本實驗以亞硒酸鈉和CPP為原料合成SeCPP，經(jīng)ICP－MS測定其中硒的質(zhì)量分數(shù)為25.92 mg·g－1。利用紫外 － 可見光譜、紅外光譜兩種表征手段對其結(jié)構(gòu)進行表征，證實了SeCPP的合成，硒化反應主要通過C6上的－OH完成。SeCPP的抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，且高于 CPP。2.0 mg·mL－1的 CPP和SeCPP對超氧陰離子自由基的清除率分別為47.05%和54.46%，對羥自由基的清除率分別為 50.20%和 61.75%。

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，富硒產(chǎn)品的種類也越來越豐富，富硒雞蛋、富硒食用菌、富硒茶葉、富硒禽肉、富硒蔬菜瓜果、富硒干果、富硒保健品等相繼出現(xiàn)。本實驗合成了一種新型的有機硒產(chǎn)品——硒化黨參多糖，為進一步研究低毒性、高活性的有機補硒劑提供了思路與參考。

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(責任編輯 鄒永紅)