劉 偉，柴文戍

銅綠假單胞菌是機(jī)體免疫力低下者急性院內(nèi)感染的重要原因，也是肺纖維化或支氣管擴(kuò)張患者慢性或反復(fù)肺感染的最常見原因[1]。綠膿菌素(PCN)是銅綠假單胞菌產(chǎn)生的毒力因子，對(duì)哺乳類細(xì)胞有很多破壞性作用。研究證明了PCN通過產(chǎn)生活性氧(ROS)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞[2]和上皮細(xì)胞[3]產(chǎn)生氧化損傷作用。一氧化氮(NO)是哺乳類動(dòng)物宿主防御的重要成分，是獨(dú)特的抗菌劑，NO抑制各種微生物的生長(zhǎng)，包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌[4]。NO衍生的活性分子，如過氧亞硝基(ONOO-)，可以誘導(dǎo)病原體氧化損傷。研究證明NO在缺血再灌注損傷時(shí)能夠防止氧化損傷，并減少哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的氧化壓力[5]。S-亞硝基-N-乙酰半胱氨酸(SNAC)是NO供體，可以改善細(xì)胞氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)主要探索PCN對(duì)感染鼠體內(nèi)ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素8(IL-8)的作用及其機(jī)制，進(jìn)一步探討SNAC對(duì)此作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 PCN購(gòu)買于Sigma公司。實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均為無(wú)病原體的8～12周齡、體質(zhì)量230～250 g的健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，N-乙酰半胱氨酸(NAC)與亞硝酸鈉(NaNO2)購(gòu)買于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將90只健康雄性SD大鼠分為對(duì)照組、PCN組和SNAC組，每組30只。對(duì)照組和PCN組大鼠分別腹腔注射1 ml/100 g 0.9%氯化鈉溶液，SNAC組大鼠腹腔注射SNAC(1 ml/100 g)。用1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)行大鼠腹腔注射麻醉，對(duì)照組氣管內(nèi)接種0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，PCN組和SNAC組分別氣管內(nèi)接種PCN 0.2 ml(6×108CFU/ml)。

1.2.2 SNAC準(zhǔn)備 NAC和NaNO2用于SNAC準(zhǔn)備[6]。由等摩爾的NAC和NaNO2混合生成SNAC水溶液，室溫條件下避光混合攪拌20 min。0.9%氯化鈉溶液稀釋SNAC到終濃度100 nmol/L并立即使用。

1.2.3 病理標(biāo)本取材及處理 分別于PCN感染后6、18、30、48、72 h，用1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)進(jìn)行腹腔麻醉,處死大鼠。然后分離氣管,經(jīng)氣管注入5 ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)行右側(cè)支氣管肺泡灌洗,反復(fù)5次,回收后注入無(wú)菌試管,回收率≥80%?；厥盏闹夤芊闻莨嘞匆?BALF)離心(離心半徑 13.5 cm,2 000 r/min，10 min),取上清液保存于-20 ℃,統(tǒng)一進(jìn)行BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。取左上肺浸泡于10%甲醛溶液中,做蘇木素-伊紅(HE)染色；取左肺余肺1 g加入9 ml 0.86%冷氯化鈉溶液制成肺組織勻漿,離心,取上清液保存于-70 ℃，統(tǒng)一進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。

1.2.4 大體觀察 分別于PCN感染后6、18、30、48、72 h觀察大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食及飲水情況及肺炎癥狀，并觀察肺組織外觀顏色、水腫、出血等炎性表現(xiàn)及鏡下觀察相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)肺臟病理組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 肺組織ROS含量、SOD活性的測(cè)定 肺組織勻漿ROS含量及SOD活性測(cè)定按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.2.6 肺組織IL-8含量的測(cè)定 使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定肺組織勻漿IL-8含量，按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)及肺組織外觀 PCN感染6 h后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、寒顫、發(fā)熱、呼吸困難，感染30 h最明顯。對(duì)照組大鼠肺外觀呈粉紅色，無(wú)明顯異常改變；PCN組PCN感染后6 h時(shí)可見肺組織表面散在點(diǎn)狀出血；18～72 h肺體積增大，肺組織暗紅色，呈片狀出血；SNAC組肺組織病變較PCN組明顯減輕。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)變化 光鏡下可見對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無(wú)增厚及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；PCN組肺組織肺泡壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞，肺泡間隔增厚，明顯充血、水腫，肺泡內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，30 h出現(xiàn)典型肺炎表現(xiàn)；與PCN組相比，SNAC組肺組織炎性表現(xiàn)明顯減輕，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整性較好，充血、水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少(見圖1)。

2.3 3組大鼠不同時(shí)間BALF細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h BALF細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時(shí)間點(diǎn)BALF細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組均增高，SNAC組各時(shí)間點(diǎn)BALF細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較PCN組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1、2)。

2.4 3組大鼠不同時(shí)間ROS含量比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h ROS含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時(shí)間點(diǎn)ROS含量較對(duì)照組均增高，SNAC組各時(shí)間點(diǎn)ROS含量較PCN組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.5 3組大鼠不同時(shí)間SOD活性比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h SOD活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時(shí)間點(diǎn)SOD活性較對(duì)照組均降低，SNAC組各時(shí)間點(diǎn)SOD活性較PCN組均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

2.6 3組大鼠不同時(shí)間IL-8含量比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h IL-8含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時(shí)間點(diǎn)IL-8含量較對(duì)照組均增高，SNAC組各時(shí)間點(diǎn)IL-8含量較PCN組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表5)。

注：a對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無(wú)增厚及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；b PCN組肺泡壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞，肺泡間隔增厚，明顯充血、水腫，肺泡內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；c SNAC組肺組織炎性表現(xiàn)減輕，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整性好，充血、水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少

圖1 PCN感染后30 h肺組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表2 3組大鼠不同時(shí)間BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表3 3組大鼠不同時(shí)間ROS含量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表4 3組大鼠不同時(shí)間SOD活性比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表5 3組大鼠不同時(shí)間IL-8含量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

3 討論

本研究結(jié)果表明PCN感染后，PCN組肺組織明顯充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，BALF檢測(cè)到炎性細(xì)胞顯著增加，以中性粒細(xì)胞為主，ROS含量增高，SOD活性降低，IL-8含量增加，說明PCN發(fā)揮毒性作用與氧化損傷有關(guān)。而SNAC干預(yù)后，SNAC組大鼠一般狀態(tài)較好，肺組織炎性表現(xiàn)減輕，BALF檢測(cè)到的炎性細(xì)胞明顯減少，ROS含量減少，SOD活性增加，IL-8含量減少，表明SNAC對(duì)小鼠體內(nèi)的PCN氧化損傷具有保護(hù)作用。研究還表明大鼠的一般狀態(tài)、肺組織病理炎性表現(xiàn)在PCN感染后30 h時(shí)表現(xiàn)最明顯。

上述表現(xiàn)其原因考慮為，SNAC是NO供體，NO不僅具有免疫調(diào)節(jié)作用而且直接作用于微生物，NO既可以殺死病原體又可以抑制其復(fù)制。許多機(jī)制參與氮氧化物的抗菌作用，包括改變蛋白質(zhì)硫醇和金屬中心的相互作用[7-8]，阻塞微生物基本生理過程[9-10]，破壞細(xì)菌的蛋白質(zhì)鐵硫集群而導(dǎo)致催化毒性氧化反應(yīng)的游離鐵的釋放[11]。NO和相關(guān)物質(zhì)通過擾亂參與DNA復(fù)制的鋅蛋白和與酪氨酰激酶反應(yīng)抑制核苷酸還原酶，進(jìn)而抑制細(xì)菌DNA復(fù)制[12]。此外，線粒體是ROS的重要來源，其損傷可能導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，SNAC能改善線粒體的功能，因此導(dǎo)致ROS產(chǎn)生減少[6]，發(fā)揮其保護(hù)氧化損傷的作用。而且有報(bào)道認(rèn)為在假單胞菌肺炎動(dòng)物模型中，吸入NO可以減少細(xì)菌的負(fù)荷[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCN通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞核組織損傷。SNAC作為NO供體，不僅具有抗菌作用，而且對(duì)氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。

研究表明PCN主要通過介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生造成氧化應(yīng)激而發(fā)揮其毒性作用，PCN可以被NAD(P)H 或硫醇直接還原，通過有氧氧化循環(huán)產(chǎn)生超氧化物(O2-)和過氧化氫(H2O2)[14]。氧化損傷是氧化和抗氧化過程失衡的結(jié)果，抗氧化防御系統(tǒng)(如SOD)在消除體內(nèi)氧化循環(huán)中起著重要作用。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，可消除過剩的氧自由基及其衍生物，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[15-17]。IL-8為重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，是宿主防御病原菌感染機(jī)制中起重要作用的前炎性細(xì)胞因子，對(duì)中性粒細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化作用和激活作用[18-19]，IL-8釋放的增加是導(dǎo)致感染肺部中性粒細(xì)胞增多最主要的原因。研究證據(jù)表明，氧化應(yīng)激可以引發(fā)炎癥，反過來炎癥加劇了活性氧的產(chǎn)生[20]；肺炎性疾病[21]、暴露于環(huán)境微粒肺細(xì)胞[22]的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)IL-8表達(dá)并乙?；?；氧化應(yīng)激能硝基化人組蛋白脫乙?；?(HDAC2)，導(dǎo)致IL-8表達(dá)增加[23]；Ivison等[24]研究表明H2O2通過磷酸化p-38 MAP酶和延長(zhǎng)I-κB降解與核因子(NF)-κB激活的協(xié)同作用使IL-8產(chǎn)生增加。因此氧化應(yīng)激引發(fā)IL-8表達(dá)上調(diào)可能是聯(lián)系氧化應(yīng)激和炎癥之間的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

總之，本研究結(jié)果提示，作為NO供體的SNAC不僅具有抗菌作用，并可能通過影響ROS、SOD的表達(dá)而發(fā)揮一定抗氧化作用，但本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的炎性因子及抗氧化酶有限，仍需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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銅綠假單胞菌是一種定植于支氣管擴(kuò)張、肺囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病患者下呼吸道的機(jī)會(huì)致病菌，可持續(xù)刺激宿主免疫反應(yīng)而致進(jìn)展性的氣道破壞，具有多重耐藥的特點(diǎn)。一旦感染，臨床治療十分困難，現(xiàn)已成為院內(nèi)感染的主要致病菌。

綠膿菌素是銅綠假單胞菌分泌的重要的細(xì)菌毒力因子之一，可降低支氣管黏液流動(dòng)速度，有利于銅綠假單胞菌定植于呼吸道；同時(shí)，它還逐步降低呼吸道纖毛擺動(dòng)，最后可發(fā)展為廣泛的纖毛停滯，進(jìn)而導(dǎo)致上皮損傷。