許 娜，周 旋，肖小珍，盧綺思，肖雅娟，高冠倫，周紅升，徐 丹，劉曉力

骨髓微環(huán)境不僅支持正?；驉盒栽煅?xì)胞的生長、增殖，還能保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物引起的凋亡，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞黏附因子介導(dǎo)耐藥[1]，是近幾年國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin，E-cad)是鈣黏蛋白家族成員之一，表達(dá)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞，介導(dǎo)造血細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相互作用，E-cad可直結(jié)合β-連環(huán)蛋白(β-catenin)形成復(fù)合物抑制Wnt/β-catenin通路激活[2]。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測急性髓系白血病(AML)患者骨髓細(xì)胞中E-cad和β-catenin基因表達(dá)水平，為深入研究骨髓微環(huán)境介導(dǎo)的耐藥提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年9月—2012年7月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科診治的初發(fā)AML患者75例(AML組)，均符合原發(fā)性AML診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，均知情同意。其中男41例，女34例；年齡為13～67歲，中位年齡35歲。按照FAB分型：M1 3例、M2 27例、M3 7例、M4 16例、M5 22例。其中55例完成染色體核型分析，包括正常核型31例，染色體異常24例。另選取同期我院診治的非惡性血液病患者20例為對照組，其中缺鐵性貧血13例，特發(fā)性血小板減少性紫癜7例；男12例，女8例；年齡為15～60歲，中位年齡34歲。兩組患者性別構(gòu)成及年齡間有均衡性。

AML組患者誘導(dǎo)緩解方案：非M3患者采用DA(柔紅霉素、阿糖胞苷)、IA(去甲氧柔紅霉素、阿糖胞苷)、TA(吡喃阿霉素、阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)方案；M3患者采用全反式維甲酸誘導(dǎo)分化治療。共有7例進(jìn)行自體干細(xì)胞移植，3例進(jìn)行異基因干細(xì)胞移植，隨訪370 d。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA 取肝素抗凝骨髓液3～5 ml，常規(guī)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)和10%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(TAKARA公司)說明書中的步驟反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測E-cad和β-catenin基因表達(dá) 引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，E-cad上游引物：5′-GGCTCAAGCTATCCTTCAC-3′，下游引物：5′-CTTGAGCCCAGGAGTTTGAG-3′；β-catenin上游引物：5′-ACCTTTCCCATCATCGTGAG-3′，下游引物：5′-AATCCACTGGTGAACCAAGC-3′；GAPDH上游引物：5′-CAGTTGCCATGTACCCCT-3′，下游引物：5′-GCTGCCCACAGAATAGCTTC-3′。按SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TAKARA公司)說明書進(jìn)行。總體系20 μl，SYBR Premix 1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，cDNA 2 μl，滅菌三蒸水7.2 μl。循環(huán)條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s；72 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均做2個(gè)平行管，取2管平均Ct值計(jì)算2-ΔCt值作為各標(biāo)本mRNA的相對表達(dá)量，-ΔCt=(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)。

比較AML組與對照組、AML組不同F(xiàn)AB分型間、AML合并髓外浸潤組與無髓外浸潤組、難治性AML組與非難治性AML組E-cad、β-catenin mRNA的表達(dá)水平，探討E-cad、β-catenin mRNA的表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系?；颊叱霈F(xiàn)下列情況之一即為髓外浸潤：(1)病理學(xué)證實(shí)為髓外浸潤；(2)臨床上有肝、脾、淋巴結(jié)腫大、牙齦增生腫脹、胸腔積液、腦脊液，或胸片、B超等客觀檢查發(fā)現(xiàn)病變，排除其他病因且化療有效。難治性AML的標(biāo)準(zhǔn)：將2個(gè)療程未達(dá)完全緩解(CR)、首次CR后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)、首次CR后6個(gè)月后復(fù)發(fā)但經(jīng)正規(guī)誘導(dǎo)化療失敗、多次復(fù)發(fā)定義為難治性AML。上述標(biāo)準(zhǔn)均參照張之南等主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。由于E-cad、β-catenin mRNA的表達(dá)水平不符合正態(tài)分布，故以中位數(shù)(M)、四分位間距(QR)描述，組間比較采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U test)；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 熔解曲線及擴(kuò)增效率一致性分析 所提取的RNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測吸光度(A)，A260 nm/A280 nm值均在1.8～2.0，純度較高，可用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測。實(shí)時(shí)定量PCR在反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)進(jìn)行了熔解曲線分析，可見到一個(gè)銳利峰形，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度均一(見圖1)，說明特異性擴(kuò)增產(chǎn)物較為單一。應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可見β-catenin、GAPDH基因PCR產(chǎn)物位于200～400 bp之間靠近200 bp處，E-cad PCR產(chǎn)物位于600～800 bp之間靠近600 bp處，與預(yù)期位置226、225、630 bp相符(見圖2)，且條帶致密、明亮，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，說明擴(kuò)增產(chǎn)物正確，引物特異性好。

注：A為E-cad，B為β-catenin，C為GAPDH

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線

Figure1 Amplification curve and melting curve of real-time PCR

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳

Figure2 2% agarose gel electrophoresis of the real-time PCR amplification product

2.2 E-cad和β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 AML組E-cad mRNA、β-catenin mRNA表達(dá)水平分別為0.003(0.007)和0.026(0.311)，與對照組的0.091(0.109)和0.004(0.011)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-5.425，P=0.000；z=-6.016，P=0.000)。AML組不同F(xiàn)AB分型間E-cad、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1 AML組不同F(xiàn)AB分型間E-cad、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較〔M(QR)〕

Table1 Comparison of expression of E-cad and β-catenin mRNA in AML patients with different FAB type

FAB分型例數(shù)E-cadβ-cateninM1 3 0.004(0.003)0.100(0.130)M2270.004(0.005)0.091(0.103)M3 7 0.005(0.004)0.032(0.029)M4160.004(0.003)0.080(0.083)M5220.003(0.004)0.107(0.098)z值7.1664.992P值0.1270.288

注：E-cad=鈣黏著蛋白，β-catenin=β-連環(huán)蛋白

2.3 E-cad和β-catenin mRNA表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，E-cad mRNA表達(dá)水平與乳酸脫氫酶水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與年齡、初發(fā)時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、外周血及骨髓原幼稚細(xì)胞比例均無線性相關(guān)(P>0.05)。β-catenin mRNA表達(dá)水平與患者年齡、初發(fā)時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、外周血原幼稚細(xì)胞比例均無線性相關(guān)(P>0.05)，而與患者乳酸脫氫酶水平、骨髓原幼稚細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P<0.05，見表2)。

表2 AML患者E-cad和β-catenin mRNA表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性

Table2 Correlation analysis between E-cad and β-catenin mRNA expression with AML clinical characteristics

M(QR)E-cadrs P值β-cateninrs P值年齡(歲) 35(36) 0.0250.833-0.2200.427白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L) 43(43) 0.0270.820 0.0200.862乳酸脫氫酶(U/L)372(381)-0.1230.000 0.5500.000外周血原幼稚細(xì)胞比例(%)32.0(31.8)-0.0430.716-0.1900.102骨髓原幼稚細(xì)胞比例(%)53.0(51.1) 0.0450.529 0.6990.000

2.4 E-cad和β-catenin mRNA表達(dá)水平與髓外浸潤及療效的關(guān)系 75例AML患者中，17例患者合并髓外浸潤(髓外浸潤組)，58例患者無髓外浸潤(無髓外浸潤組)。兩組患者E-cad、β-catenin mRNA表達(dá)水平間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

75例AML患者中，3例患者放棄治療、4例患者治療不足1療程未列入統(tǒng)計(jì)，其余68例患者均列入治療反應(yīng)分析，其中難治性AML組14例，非難治性AML組54例。兩組患者E-cad、β-catenin mRNA表達(dá)水平間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

表3 髓外浸潤組和無髓外浸潤組AML患者E-cad、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較〔M(QR)〕

Table3 Comparison of E-cad and β-catenin mRNA with and without extramedullary leukemia in AML

組別例數(shù)E-cadβ-catenin髓外浸潤組170.001(0.001)0.140(0.152)無髓外浸潤組580.004(0.006)0.098(0.099)z值-4.080-5.990P值 0.000 0.000

表4 難治性AML組和非難治性AML組患者E-cad、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較〔M(QR)〕

Table4 Comparison of E-cad，β-catenin mRNA expression with and without refractory leukemia in AML

組別例數(shù)E-cadβ-catenin難治性AML組140.002(0.002)0.120(0.130)非難治性AML組540.015(0.016)0.045(0.045)z值7.83611.019P值0.030 0.021

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)E-cad介導(dǎo)的細(xì)胞黏附除了與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)外，還可能參與細(xì)胞存活[4]。有研究表明，E-cad功能失活可能破壞造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)間的細(xì)胞黏附和信號傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)造血細(xì)胞惡性增殖并向外周血逃逸[5]。E-cad部分功能需依賴β-catenin來完成，細(xì)胞膜上的β-catenin可與E-cad內(nèi)肽段結(jié)合形成復(fù)合體進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的形成及黏附。生理情況下β-catenin主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄活性是低的，主要以介導(dǎo)黏附作用為主；如果在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)β-catenin的聚集，將激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖。

E-cad表達(dá)缺失時(shí)，一方面β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集到一定量后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合形成TCF/LEF/β-catenin復(fù)合體，TCF/LEF抑制作用被解除，由轉(zhuǎn)錄抑制劑轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活劑，特異地啟動(dòng)下游靶基因如c-myc、CyclinD1等癌基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，引起細(xì)胞增殖加快，從而抵抗凋亡；另一方面，可使白血病細(xì)胞從彼此的連接中解離、遷移出來，并破壞造血微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，獲得侵襲性表型，使白血病細(xì)胞脫離其他細(xì)胞的黏附并進(jìn)一步分散和轉(zhuǎn)移。最近亦有報(bào)道E-cad在維持胚胎干細(xì)胞歸巢及抑制腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用[6]。

E-cad、β-catenin在上皮起源腫瘤中的作用已基本明確，而對其在血液系統(tǒng)惡性疾病中的作用研究相對較少。唐克晶等[7]應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測出急性白血病患者E-cad低表達(dá)或缺失可能與E-cad基因CDH1啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。Xu等[8]采用免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在AML中表達(dá)增高，且與預(yù)后密切相關(guān)，其中β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的異常積累是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而蛋白水平的增高涉及其合成的增多及降解的減少，Wnt通路主要在蛋白降解水平上對β-catenin進(jìn)行調(diào)節(jié)，而對于β-catenin轉(zhuǎn)錄水平的研究國內(nèi)外報(bào)道較少。饒青等[9]研究發(fā)現(xiàn)，E-cad細(xì)胞膜表達(dá)缺失與其甲基化有關(guān)，而β-catenin在AML中存在定位異常，進(jìn)而推測β-catenin的異常定位可能參與白血病的發(fā)生，但該異常定位是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上尚不明確。目前關(guān)于白血病細(xì)胞中是否存在β-catenin轉(zhuǎn)錄水平異常仍存在爭議。

本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測了75例AML患者E-cad和β-catenin的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與非惡性血液病患者比較，AML患者E-cad基因失表達(dá)或低表達(dá)，β-catenin基因表達(dá)水平則較高；同時(shí)，AML合并髓外浸潤者β-catenin mRNA表達(dá)水平明顯升高，而E-cad mRNA幾乎不表達(dá)。E-cad介導(dǎo)的細(xì)胞黏附使上皮細(xì)胞保持正常極性及同型細(xì)胞緊密連接的分子基礎(chǔ)，在正常上皮細(xì)胞生長的“接觸抑制”中起著重要作用[10-11]。因此，推測在AML中低表達(dá)或失表達(dá)的E-cad使cadherin-catenin復(fù)合體難以形成，而黏附復(fù)合體結(jié)構(gòu)的破壞，使細(xì)胞之間的黏附能力降低，從而促進(jìn)急性白血病細(xì)胞髓外浸潤的形成。進(jìn)一步分析E-cad、β-catenin基因表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)β-catenin mRNA表達(dá)水平與患者乳酸脫氫酶水平、骨髓原幼稚細(xì)胞比例呈正相關(guān)；且在難治性AML中，β-catenin表達(dá)水平明顯增高，可能因?yàn)榧?xì)胞膜E-cad表達(dá)的缺失，破壞了E-cad維持細(xì)胞間黏附的平衡，并促進(jìn)了β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的聚集，從而激活Wnt/β-catenin通路，導(dǎo)致白血病細(xì)胞惡性增殖、凋亡受抑。

本研究初步證實(shí)了E-cad缺失可引起β-catenin被釋放轉(zhuǎn)入細(xì)胞核引起一系列癌基因的轉(zhuǎn)錄，為闡明E-cad介導(dǎo)的造血細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞間相互作用的喪失在白血病發(fā)生中的作用及機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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