王紅梅，厚毅清，歐巧明

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070）

小麥干種子基因組DNA的提取及效果研究

王紅梅，厚毅清，歐巧明

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070）

分別采用試劑盒和CTAB法提取小麥干種子基因組DNA，DNA樣品經(jīng)紫外光譜吸收、瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴增檢測。結(jié)果表明，試劑盒提取DNA操作過程快速簡便、成本較低，DNA產(chǎn)率和純度優(yōu)于CTAB法。通過多重PCR技術(shù)分別以小麥LMW-GS亞基Glu-B3位點和黑麥堿secalin-p基因的特異引物進行擴增，均能夠擴增出清晰的目標條帶，提取的基因組DNA能夠滿足分子檢測的實驗要求。

小麥；干種子；基因組DNA；提取效果

小麥是我國主要糧食作物之一，目前關(guān)于小麥分子生物學(xué)方面的研究日益深入，先進技術(shù)如基因克隆與轉(zhuǎn)化、遺傳圖譜構(gòu)建、特定基因型檢測、分子標記輔助育種及DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等在小麥育種中廣泛應(yīng)用［1～6］。高質(zhì)量DNA的提取是在分子水平上對植物進行系統(tǒng)分析與研究的基礎(chǔ)，關(guān)于植物基因組DNA提取的方法有很多［7～8］，但多數(shù)需要以植物新鮮組織為材料提取基因組，這就需要在植物生長季節(jié)取樣或通過室內(nèi)培養(yǎng)提供，并且需要液氮研磨，存在步驟多、耗時長等缺點。植物干種子在常溫下可穩(wěn)定保存，用種子提取DNA不受季節(jié)和形態(tài)的限制，具有極大的便利性［9～11］。我們以小麥干種子為實驗材料，分別采用試劑盒和CTAB法提取基因組DNA，并對DNA產(chǎn)率、純度和提取成本進行了對比分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供。植物基因組DNA提取試劑盒DP305和DNA Marker Ⅴ購自北京天根生化科技有限公司，PCR擴增引物由invitrogen北京生物科技有限公司合成，Taq DNA聚合酶、RNA酶、dNTP等生化試劑均購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司，CTAB、Tris-Cl、EDTA-Na2、酚-氯仿等化學(xué)試劑均為分析純。

超低溫冰箱為SANYO ULTRA LOW MDF-382E，電子天平為Explorer OHAUS公司生產(chǎn)的萬分之一分析天平，臺式高速離心機型號為Heraeus D-37520，PCR儀為BIO-RAD T100TM。凝膠成像分析系統(tǒng)為BIO-RAD Gel DocTMXR+，電泳儀為DYY-III7B型，電熱恒溫水浴鍋為HWS24，紫外可見分光光度計為Helios Alpha，微量移液器為Eppendorf等。

1.2 方法

1.2.1 小麥種子基因組DNA提取選取少量小麥種子，用小塊干凈布包起來并用鉗子夾碎，再用研缽研成粉末（或者采用微量種子破碎儀磨粉），將大約100 mg粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，CTAB提取DNA參照魏琦超等的方法［12］，試劑盒提取方法參照DP305試劑盒使用說明書。每處理一個樣徹底清理儀器，以免DNA樣品之間的交叉污染。

1.2.2 DNA純度和濃度的測定將2 μL DNA用雙蒸水稀釋至500 μL，用紫外分光光度計測定樣品液在230、260、280 nm波長下的吸光值，并計算OD260/ OD230，OD260/ OD280的值。DNA樣品的濃度（μg / μL）=OD260×稀釋倍數(shù)×0.05。

1.2.3 DNA分子量大小及完整性的檢測取2 μL DNA溶液、5 μL dd H2O和3 μL上樣緩沖液混勻點樣，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，在凝膠成像儀上進行觀察并照相。用標準分子量Marker及Image lab 4.0軟件估算DNA條帶分子量大小。

1.2.4 PCR擴增檢測根據(jù)1.2.2中測定的DNA濃度，將所有DNA樣品的濃度稀釋至50 ng /μL，取1 μL DNA稀釋液作為模板，以小麥1BS上的LMW-GS亞基Glu-B3 基因和黑麥1RS上的secalin-p基因的特異引物進行擴增，反應(yīng)體系為20 μL。PCR 擴增引物［13～14］和擴增條件見表1。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓5～10 V/cm，電泳時間30 min。

表1 多重PCR擴增引物和擴增條件

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA樣品的產(chǎn)率和純度

采用試劑盒可以從大約100 mg的小麥粉中提取DNA平均約7.5 μg，OD260/ 0D280比值在1.75～1.94，表明蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)去除干凈，且無RNA污染，DNA樣品產(chǎn)率高、純度好。而用CTAB法從大約100 mg的小麥粉中提取DNA平均約2.8 μg，OD260/ 0D280比值比較分散，在1.6～2.3，大于2.0的樣品有RNA污染，小于1.7的存在蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)。可見使用試劑盒提取的DNA在產(chǎn)量和純度上都優(yōu)于CTAB法。

2.2 改良CTAB法提取DNA的完整性

由圖1可以看出，采用試劑盒和CTAB法提取的DNA電泳譜帶單一整齊，證明2種方法都可以從小麥干種子中提取較為完整的總DNA，經(jīng)Image lab 4.0軟件估算分子量大小為50 kb左右，但提取效果存在明顯差異。由試劑盒提取的DNA電泳條帶整齊清晰，蛋白、RNA去除徹底，而CTAB法提取的DNA電泳條帶弱，點樣孔有少量蛋白質(zhì)或多糖類物質(zhì)殘留，泳道有不同程度的拖尾現(xiàn)象，可能在提取過程中由于操作步驟繁瑣、時間長，使DNA分子發(fā)生少量降解，同時存在少量的RNA污染。

圖1 小麥種子中提取的基因組DNA電泳圖譜

2.3 樣品DNA多重PCR擴增結(jié)果

以小麥干種子提取的DNA為模板，及小麥Glu-B3位點和黑麥Sec-p基因的特異引物進行多重PCR擴增的結(jié)果（圖2）表明，Glu-B3和Sec-p位點PCR擴增片段大小分別為630 bp和1 076 bp，與預(yù)期目標片段大小一致。由試劑盒提取的樣品擴增產(chǎn)物亮度強，條帶清晰，CTAB法提取的模板擴增效果較差。

圖2 小麥Glu-B3、黑麥Sec-p位點PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖譜

2.4 成本比較

提取小麥干種子基因組DNA，采用試劑盒和CTAB法的實驗成本相當(dāng)。試劑盒價格雖然較高（100次樣本價格為600元），但在2 d內(nèi)即可輕松完成從磨樣、DNA提取到瓊脂糖凝膠電泳檢測等工作，實驗成本約7.2元/樣品，效果好且省時又省力。CTAB法從小麥干種子提取DNA，100個樣品從磨樣到DNA提取純化完成需5 d時間，人工加試劑費用，估算成本為8.0元/樣品，比試劑盒提取成本稍高但效果不如試劑盒。

3 小結(jié)與討論

1）采用試劑盒

從小麥干種子提取基因組DNA產(chǎn)率高、純度好。100 mg樣品提取DNA量平均為7.5 μg，OD260/ 0D280比值為1.75～1.94，DNA片段大小完整、不干擾酶活性等，能夠滿足分子檢測、遺傳標記等分子生物學(xué)實驗。CTAB法DNA產(chǎn)率較低，存在蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，有少量RNA污染，雖然對PCR擴增影響不大，但DNA量偏少，遠不能滿足酶切、基因位點多態(tài)性分析等實驗需求，該提取方法有待進一步改良。

2）一般認為，試劑盒提取DNA的實驗成本遠高于常規(guī)的CTAB法。但我們多次實驗證明，試劑盒的實驗成本低于后者。以100個樣本來估算，采用CTAB法從植物幼嫩葉片中提取DNA質(zhì)量，從獲得小麥實生苗、溶液配制與消毒、磨樣到DNA提取純化完成最少需要11 d時間，熟練實驗工人工費以60元/d計，加上化學(xué)試劑及液氮等的費用，實驗成本大于10元/樣品（不包括水電費及儀器設(shè)備折舊費），工作量大、耗時而且成本不低。目前，隨著勞動力市場人工工資的逐年上漲，人工費在所有實驗成本中占相當(dāng)大的比例，是導(dǎo)致實驗成本不斷上升的主要因素。

3）小麥干種子DNA在常溫下不易降解，可方便在任何季節(jié)和環(huán)境下提取。試劑盒操作方法快速簡便，但需要注意種子磨粉一定要充分呈細粉狀，取樣盡量不帶麩皮；樣品量控制在100～150 mg，若大于150 mg反而會降低DNA產(chǎn)量；65 ℃恒溫水浴時間由30 min延長到1 h，每隔10 min輕輕顛倒離心管幾次使提取緩沖液與樣品充分混勻，注意操作細節(jié)可以大大提高DNA產(chǎn)率和純度。

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（本文責(zé)編：王建連）

Study on the DNA Extraction Effects from Dry Seeds of Wheat

WANG Hong-mei，HOU Yi-qing，OU Qiao-ming
（Institute of Biotechnology，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China）

Two rapid DNA isolation methods from dry seeds of wheat was established by DNA extraction kit and CTAB in this study. The DNA samples were detected in terms of the UV spectrophotometer analysis，agarose gel electrophoresis，PCR amplification respectively. The results indicats that the method with DNA Extraction Kits was simple，rapid and low costs，the extraction rate and purity of DNA was better than that of the CTAB. Using the DNA samples as template，the Glu-B3 locus of wheat LMW-GS and ω-secalin gene of triticale could be amplified with distinct and specific target bands by multiplex PCR. The genomic DNA extracted from dry seeds of wheat can meet the needs of molecular tests.

Wheat；Dry seeds；Genomic DNA；Extraction effects

S512.1；Q781

A

1001-1463（2014）10-0013-03

10.3969/j.issn.1001-1463.2014.10.005

2014-07-08

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項“甘肅小麥品種資源1BL/1RS易位系的分子標記檢測研究”（2012GAAS06-4）、甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目“持久條銹病抗源BJ144抗銹基因發(fā)掘及抗銹小麥新品系的培育”（GNSW-2011-07）、甘肅省科技支撐計劃項目“小麥5B染色體基因組抗銹基因關(guān)聯(lián)分析及抗銹新品系培育”（1304NKCA142）部分內(nèi)容

王紅梅（1972—），女，甘肅靈臺人，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用研究。聯(lián)系電話：（0）13893659623。E-mail：676640934@qq.com